Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen
Summary
Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.
Abstract
Alvleesklier endocriene cellen, die zijn geclusterd in eilandjes, reguleren bloed glucose stabiliteit en stofwisseling. De verschillende celtypen in eilandjes, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende, worden onderscheiden van gemeenschappelijke endocriene progenitoren tijdens de embryonale fase. Onrijpe endocriene cellen breiden via celproliferatie en volwassen gedurende een periode van lang postnatale ontwikkelingsstoornissen. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen niet duidelijk zijn gedefinieerd. Eencellige RNA-rangschikken is een veelbelovende aanpak voor de karakterisering van verschillende cel populaties en tracering cel lineage differentiatie trajecten. Hier beschrijven we een methode voor de eencellige RNA-sequencing van geïsoleerde alvleesklier β-cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases.
Introduction
De alvleesklier is een vitaal metabole orgaan in zoogdieren. De alvleesklier bestaat uit endocriene en exocrine compartimenten. Alvleesklier endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-producerende en glucagon-producerende α cellen, cluster samen in de eilandjes van Langerhans en betekenisdragers regelen systemische glucose homeostase. Dysfunctie van de resultaten van de endocriene cellen in diabetes mellitus, die uitgegroeid een belangrijke volksgezondheidskwestie wereldwijd tot is.
Alvleesklier endocriene cellen zijn afgeleid van Ngn3+ progenitoren tijdens de embryogenese1. Later, tijdens de perinatale periode vermenigvuldigen de endocriene cellen tot formulier onvolwassen eilandjes. Deze onvolwassen cellen blijven ontwikkelen en langzamerhand volwassen eilandjes, die worden rijkelijk gevacuoliseerd voor het regelen van bloed glucose homeostase in volwassenen2.
Hoewel een groep van transcriptionele factoren is geconstateerd dat het reguleren van de celdifferentiatie β, is het traject van de precieze rijping van β-cellen nog onduidelijk. Bovendien impliceert het rijpingsproces van β cel ook de regulering van de cel nummer expansie3,4 en de generatie van cellulaire heterogeniteit5,6. Echter zijn de regulerende mechanismen van deze processen niet goed bestudeerd.
Eencellige RNA-rangschikken is een krachtige aanpak die kan profile cel subpopulaties en traceren van cel lineage ontwikkelings trajecten7. Voordeel van deze technologie, de gebeurtenissen die zich tijdens de ontwikkeling van de alvleesklier islet voordoen kunnen worden ontcijferd in het eencellige niveau8sleutel nemen. Onder de eencellige RNA-sequencing protocollen kunt Smart-seq2 de generatie van full-length cDNA met verbeterde gevoeligheid en nauwkeurigheid, en het gebruik van standaard reagentia bij lagere kosten9. Smart-seq2 duurt ongeveer twee dagen voor de bouw van een cDNA Bibliotheek voor sequencing10.
Hier stellen wij een methode voor de isolatie van fluorescentie-geëtiketteerden β-cellen uit de pancreases van foetale naar volwassen Ins1-RFP transgene muizen11, met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS), en de prestaties van transcriptomic analyseert op de eencellige niveau, met behulp van Smart-seq2 technologie (Figuur 1). Dit protocol kan worden uitgebreid tot het analyseren van de transcriptomes van alle soorten van de alvleesklier endocriene cellen in normale, veroudering en pathologische staten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, wij blijk gegeven van een effectieve en eenvoudig-en-klare methode voor het bestuderen van de eencellige expressieprofielen alvleesklier β-cellen. Deze methode kan worden gebruikt om te isoleren van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases en eencellige transcriptomic-analyses uitvoeren.
De meest kritische stap is het isolement van één β-cellen in goede conditie. Volledig geperfundeerd pancreases reageren beter op daaropvolgende spijsverterin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het nationale centrum voor eiwit wetenschappen, Beijing (Peking University) en de Peking-Tsinghua Center voor de Life Science Computing-Platform. Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie van China (2015CB942800), de nationale Natural Science Foundation van China (31521004, 31471358 en 31522036) en financiering van Peking-Tsinghua centrum voor Life Sciences C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
