JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
환경과학

De beoordeling van de gezondheid van de necropsie gebaseerde wilde vis

Published: September 11, 2018
doi:
10.3791/57946
, , ,
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center,U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources,West Virginia University

Summary

De gezondheid van de wilde vissen kan worden gebruikt als een indicator van de gezondheid van aquatische ecosysteem. Documentatie van de zichtbare laesies of afwijkingen, gegevens die worden gebruikt voor de berekening van de voorwaarde-indicatoren, alsmede de mogelijkheid om het verzamelen van weefsels voor microscopische evaluatie, genuitdrukking en andere meer diepgaande necropsie gebaseerde vis medische keuringen te verstrekken analyses.

Abstract

Antropogene invloeden uit meer voedingsstoffen en chemische verontreinigingen, wijzigingen van de habitat en de verandering van het klimaat, kunnen aanzienlijke gevolgen hebben voor vispopulaties. Bijwerkingen monitoring, kunnen met behulp van biomarkers van de organisch op moleculair niveau, worden gebruikt om te beoordelen van de cumulatieve effecten op vissen en andere organismen. Vis gezondheid is wereldwijd als een indicator van de gezondheid van aquatische ecosysteem gebruikt. De gezondheidsbeoordeling van necropsie gebaseerde vis biedt gegevens over zichtbare afwijkingen en letsels, parasieten, voorwaarde en organosomatic indices. Dit kunnen worden vergeleken door site, seizoen en seks en stoffelijk, document verandering in de tijd. Prioriteitsniveaus kunnen worden toegewezen aan verschillende opmerkingen voor het berekenen van de gezondheidsindex van een vis voor meer kwantitatieve beoordeling. Een nadeel van de necropsie gebaseerde beoordeling is dat het is gebaseerd op visuele observaties en voorwaarde factoren, die niet zo gevoelig als weefsel- en subcellular biomarkers voor subletale effecten. Bovendien is het zelden mogelijk om oorzaken of risico factoren die samenhangen met de geconstateerde afwijkingen te identificeren. Dus, bijvoorbeeld een verhoogde laesie of “tumor” op de vinnen, lippen of lichaamsoppervlak kunnen een maligniteit. Het kan echter ook een reactie op een parasiet, chronische ontsteking of hyperplasie van de normale cellen in reactie op een irriterend zijn. Omgekeerd, gezwellen, bepaalde parasieten, andere infectieuze agentia en veel weefsel veranderingen zijn niet zichtbaar en dus kunnen worden onderschat. Echter tijdens de necropsie gebaseerde beoordeling, het bloed (plasma), de weefsels voor histopathologisch onderzoek (microscopische pathologie), kunnen genomics moleculair analyses, en andere Otolieten voor veroudering worden verzameld. Deze downstream analyses, samen met georuimtelijke analyses, evaluaties van de habitat, water kwaliteit en verontreiniging analyses allemaal kunnen worden belangrijk in uitgebreide ecosysteem evaluaties.

Introduction

Menselijke activiteiten hebben talrijke nadelige gevolgen voor het aquatisch milieu. Vissen bewonen verschillende waterlichamen die de menselijke populatie herschept en vaak gebruikt als een bron van drinkwater en vandaar zijn belangrijke indicatoren van de gezondheid van het aquatisch milieu. Wilde vis die wonen en reproduceren in een bepaald leefgebied worden blootgesteld gedurende het hele leven verschillende stressoren met inbegrip van ziekteverwekkers, chemische verontreinigingen, parasieten en slechte waterkwaliteit. Duizenden chemicaliën voer onze waterwegen door industriële en menselijke afvalwater, suburban/stedelijke hemelwater en agrarische afvoer. Deze complexe mengsels van chemische stoffen kunnen hebben additieve, synergetische of antagonistische effecten op blootgestelde organismen1,2,3. Daarnaast andere milieustressoren zoals verhoogde voedingsstoffen, hoge temperatuur, lage gehalte aan opgeloste zuurstof of fluctuerende pH kan verergeren de effecten van chemische contaminanten4,5. Milieustressoren kunnen ook infectieziekte uitkomsten beïnvloeden rechtstreeks door verhoging van het aantal infectieuze agentia6, verhoging van de virulentie van opportunistische pathogenen7 of onderdrukken van de immuunrespons en ziekte weerstand van de gastheer8,9,10. Om deze redenen is er toenemende belangstelling voor biologische of nadelige effecten toezicht11,12,13,14, gebruik makend van vissen en andere aquatische organismen te identificeren populaties en ecosystemen in gevaar.

Bijwerkingen toezicht maakt gebruik van biomarkers op verschillende niveaus van organisatie, van de organisch aan de subcellular of moleculaire, subletale effecten die indicatief zijn voor blootstelling aan verschillende stressoren kunnen beïnvloeden populaties te kunnen identificeren. Indicatoren op het niveau organisme zijn zichtbare afwijkingen en voorwaarden. Voorwaarde-indicatoren gebaseerd op lengte en gewicht worden berekend om te evalueren van het welzijn of de geschiktheid van vispopulaties. De meest voorkomende is Fulton de voorwaarde factoren (K) = (gewicht/lengte3) 15. Een andere indicator is de aanwezigheid van zichtbare afwijkingen. Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt in de individuele studies en controleprogramma’s beoordelen, document, en evalueren van zichtbare afwijkingen. Evaluatie alleen gebaseerd op externe afwijkingen, dat wil zeggen, het aandeel van de personen met de ziekte, fin schade, tumoren en skeletale anomalieën, is een van de statistieken voor de index van biotische integriteit (IBI) die wordt geëvalueerd als communautaire gezondheid16. Een soortgelijke evaluatie genoemd DELTs (misvormingen erosies, laesies, tumoren) is ook gebruikt om te evalueren van de gezondheid van vissen gemeenschappen17. Echter, deze methoden beoordelen alleen externe visuele afwijkingen en geen interne laesies of vroege subletale indicatoren.

Necropsie gebaseerde beoordeling omvatten externe en interne opmerkingen en toestaan voor de meting van extra voorwaarde indexcijfers. Hepatosomatische index (lever gewicht/totaal lichaamsgewicht) is ook gebruikt als een indicator van fitness of energie reserves15 waarvoor een hogere indexwaarde geeft aan gezonder vis. Een aantal studies hebben echter aangetoond dat hypertrofie of een toename van de grootte van de lever als gevolg van blootstelling aan verschillende verontreinigende stoffen gemetaboliseerd door de lever18,19,20 optreedt. In dit geval zou een hogere index indicatieve van blootstelling aan bepaalde chemische klassen. De gonadosomatic-index (gonaden gewicht/totaal lichaamsgewicht) is een andere voorwaarde index gericht op reproductieve gezondheid21. Opmerkingen tijdens de necropsie gebaseerde beoordeling kunnen worden gebruikt om de prevalentie van individuele laesie typen of percentage van de normale personen te vergelijken. Ze kunnen echter ook worden gebruikt in een meer kwantitatieve gezondheid beoordeling22,–23.

De gestandaardiseerde necropsie gebaseerde beoordeling hier beschreven kan worden gebruikt om uit te breiden van de grove zichtbaar beoordeling op meerdere manieren afhankelijk van de vragen worden beantwoord, deskundigheid en andere middelen. Onze routine aanpak is het verzamelen van biometrische gegevens (lengte, gewicht, lever gewicht, gewicht van de gonaden), blood voor plasma/serum analyses, document externe en interne zichtbare afwijkingen, bewaren van stukken van organen voor microscopische analyses en verzamelen Otolieten voor leeftijd analyses. De necropsie gebaseerde beoordeling plus leeftijd analyse en histopathologisch onderzoek van de verschillende organen, voorziet in de berekening en de vergelijking van verschillende voorwaarde indices, prevalentie van zichtbare afwijkingen, alsook de microscopische weefsel veranderingen, geslacht, leeftijd, site en bemonstering. Extra weefsel collecties kunnen worden gemaakt voor vele andere analyses, met inbegrip van elektronenmicroscopie, Bacteriologie, virologie, parasitologie en chemische concentraties. Deze methoden kunnen ook deel uitmaken van meer diepgaande analyses gebruikt voor de diagnose van de oorzaak van vis doodt24 of sterfte van gevangenschap vist25. Methoden voor het verzamelen van weefsel voor twee aanvullende analyses, genuitdrukking en functionele immuun analyses worden geïllustreerd.

Protocol

Methoden die hier worden beschreven zijn door de Leetown Science Center van institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd. 1. vis collectie Het verzamelen van levende vis met een minimum aan stress. Boot of rugzak Pulsvisserij, haak en telefoonlijn of netten gebruiken. Houden vis in live putten of cellenbeton containers tot bemonstering.Opmerking: De American Society van de visserij heeft een aantal gidsen voor vis inzameling, behandeling en anesthesie/euthanasie26,27,28gepubliceerd. Draag handschoenen bij hantering van de vis. 2. vis necropsie Euthanaseren van een vis. Plaats de vis in de verdoving tot operculaire verkeer ophoudt en de vis evenwicht verliest. Na een andere 2 – 10 min zal de vis euthanized worden; Dit kan echter ook variëren per soort.Opmerking: Vis kan worden euthanized met een aantal verdoving (Zie Tabel van materialen voor de meest gebruikte). De methode van euthanasie zal afhangen van de laboratorium metingen die op weefsels verzamelde29 plaatsvinden zal. Biometrische kenmerken van de maatregel. De vis tot de dichtstbijzijnde gram wegen. Meet de lengte van de vis en de dichtstbijzijnde millimeter. Meet de totale lengte vanaf het puntje van de snuit met de mond gesloten aan het einde van de staart bij elkaar geknepen. Meet de lengte van de vork van de vork in de staart naar het uiteinde van de snuit, en de standaard lengte vanaf de punt van de snuit tot het einde van het lichaam (begin van de staart). Bereken de factor van de toestand met de volgende formule:Voorwaarde factor = (totale lichaamsgewicht – gonaden gewicht) / totale lengte3.Opmerking: Gonaden gewicht wordt afgetrokken van het totale lichaamsgewicht aangezien gonaden aanzienlijk aan de totale lichaamsgewicht, met name in prespawn vrouwelijke vissen bijdragen kunnen. Het verkrijgen van een bloedmonster.Opmerking: Bloed is meestal ontleend aan de caudal ader maar kan ook worden onttrokken aan de dorsale aorta of door cardiale doorprikken30. Pak een perifeer bloedmonster uit de caudal ader met een 22 of 23 G naald op de spuit van een 1 tot en met 5 mL, afhankelijk van de grootte van de vis. Plaats de naald anterior to het caudal gebied onder de zijlijn (figuur 1A en 1B). Hoek het omhoog tot de wervelkolom raken en dan iets te trekken. De ader is ventrale aan de bovenliggende wervelkolom.Opmerking: Als bloed uitstrijkjes zal worden gemaakt of serum vereist is, geen antistollingsmiddel wordt gebruikt. In de meeste gevallen plasma zal worden verzameld en, vandaar, een antistollingsmiddel zoals Natrium heparine, EDTA of lithium wordt gebruikt om de jas van de naalden en spuiten en is ook in het bloed collectie buis (b.v., vacutainer). Verwijder de naald en plaats verpakkingsgasssen verwijdering slijpsel vóór invoering van het bloed in de buis van de collectie.Opmerking: Bloed kan plaatsvinden op het ijs, maar afhankelijk van de latere analyses moet zo spoedig mogelijk30worden gecentrifugeerd. Als nucleaire afwijkingen of differentiële bloed graven zal worden geëvalueerd, moet u onmiddellijk een druppel bloed op dubbele schoon glas Microscoop dia’s plaatsen. Terug een tweede dia in een hoek van 45° in de daling, die dan over het oppervlak door capillaire werking getrokken is. Laat drogen van31. Centrifugeren van bloed bij 1500-2500 x g gedurende 15 min naar sediment de cellen. Plasma/serum met een steriele overdracht Pipetteer, aliquoot in cryogene flesjes, verwijderen en opslaan bij-80 ° C. Figuur 1 : Het verkrijgen van een bloedstaal van een vis. (A) A onlangs euthanized vis wordt gelegd op zijn kant en de zijlijn gelegen. (B) een naald is ingevoegde ventrale aan laterale lijn (pijl), schuin omhoog totdat naald raakt de ruggengraat. Het is vervolgens iets ingetrokken, en zuig gestart om bloed te trekken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Voeren een necropsie gebaseerde gezondheidsbeoordeling op elke vis.Opmerking: Een aantal publicaties te illustreren en beschrijven van laesies en afwijkingen zijn beschikbaar32,33,34,35. Externe afwijkingen document met inbegrip van laesies op lichaamsoppervlak en de vinnen (Figuur 2), de ogen en de kieuwen (Figuur 3), externe parasieten zoals bloedzuigers (figuur 2D), de larven of de trematode metacercarial cysten (figuur 2D, 3B) en gill parasieten (figuur 3D). Document type, de locatie en de grootte van de geconstateerde afwijkingen op gegevensbladen, zo goed als fotografisch, indien mogelijk. Open de buikholte (figuur 4A) met behulp van een schaar door te snijden uit het anale gebied aan de operculum en vervolgens het verwijderen van de klep van de spier aan het blootstellen van de inwendige organen.Opmerking: Als anterior nier worden verzameld voor immune functie (zie stap 5 hieronder) of monsters verzameld voor bacteriologie of Virologie, de externe lichaamsoppervlak moet ontsmet worden met 70% alcohol en deze monsters moeten worden verkregen voordat de necropsie verricht. Als weefsels alleen voor visuele waarnemingen, plasma analyses en histopathologie steriele gebruikt worden is techniek niet nodig. Document interne afwijkingen (Figuur 4) met inbegrip van algemene of focal verkleuringen van de verschillende organen (figuur 4B-4D), aanwezigheid van opgeheven gebieden (figuur 4E), cysten, parasieten, en de grootte van de afwijkingen ( vergroot, afgestorven). Figuur 2 : Voorbeelden van zichtbare letsels waargenomen op lichaamsoppervlak en vinnen van de vis. (A) A kleine, enigszins geërodeerde laesie (pijl) op het van de laterale lichaamsoppervlak. (B) een grote rode gebied (pijl) waarbij de caudal lichaamsoppervlak. (C) verhoogd, zwarte laesies (pijlen) op het lichaamsoppervlak en vinnen. (D) bloedzuigers (witte pijl) en kleine zwarte stippen (zwarte pijlen) op de fin. Schaal bar = 3 mm. (E) een verhoogd, multilobed, bleke laesie (pijl) op het lichaamsoppervlak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Voorbeelden van de zichtbare laesies van de kieuwen en eyes of vis. (A) A pale gebied (pijl) binnen de lens van een oog. Schaal bar = 5 mm. (B) witte cysten (witte pijlen) en kleine zwarte stippen (zwarte pijlen) veroorzaakt door trematode parasieten op de operculum die betrekking hebben op de kieuwen (a). Schaal bar = 1 cm. (C) A pale, geërodeerde gebied (pijl) op de gill (a). Schaal bar = 5 mm. (D) een gill die is verwijderd met parasieten (pijlen) gekoppeld aan de gill-filamenten. Schaal bar = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Voorbeelden van een necropsie en interne afwijkingen van vis. (A) tijdens een necropsie de vis is opengesneden (langs de witte pijl) en een klep van spier (zwarte pijl) verwijderd bloot de gonaden (a) en de milt, vastgehouden door de Tang en schaar. (B) gevlekt lever (a), testes, onder b, darm omgeven door obesitas vet (c) en maag (d). Schaal bar = 5 mm. (C) lever (a) met een donker rode gebied (pijl), eierstok (b) en darmen (c). Schaal bar = 5 mm. (D) lever met groenige verkleurde gebieden (pijlen). Schaal bar = 1 cm. (E) voorbeeld van een normale (a) en abnormale b teelballen met verhoogd knobbeltjes. Schaal bar = 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Hepatosomatische index (HSI) opvragen. Verwijder de lever door doorsnijden omvat de hepatische slagader en het bindweefsel van het anterieure einde. Zachtjes til terwijl trimmen verklevingen en andere verbindingen met de darm en obesitas vet. Zorg niet doorprikken van de galblaas. Weeg de lever.Opmerking: Sommige vissen, zoals cypriniden, hoeft niet een discrete lever maar eerder hepatische weefsel gewikkeld rond de darmen en andere organen. Voor deze soorten, het niet mogelijk om te verkrijgen lever gewichten. Hepatosomatische index (HSI) met behulp van de formule wordt berekend:HSI = lever gewicht/totaal gewicht Berekening van de gonadosomatic-index. Verwijder de gonaden en wegen. Gonadosomatic index (GSI) met behulp van de formule wordt berekend:GSI = gonaden gewicht/totaal gewicht 3. het bewaren van weefsels voor microscopische pathologie Opmerking: Er is een aantal fixatives waaronder 10% neutraal gebufferde formaline en Z-fix, een hechtmiddel formaline gebaseerde met zink, inzetbaar voor behoud van weefsel in het gebied. De laatste heeft de voorkeur als methoden zoals in situ hybridisatie of fluorescerende antilichamen kleuring mogen worden gebruikt. Zorgvuldig gesneden maar trek niet uit weefselmonsters. Houden van individuele weefsel stukken < 2 cm groot en < 5 mm dik voor goede fixatie. Als een vuistregel, gebruik ongeveer 10 x meer fixeerspray volumepercentage dan het weefsel voor goede conservering. Plaats alle weefselmonsters van één vis in de dezelfde waterdichte container van de juiste maat, afhankelijk van de grootte van de vissen worden bemonsterd. Leg stukjes van eventuele externe afwijkingen in de kleefpoeders container. Ook een aangrenzende stukje normale weefsel.Opmerking: Onjuiste behandeling zoals compressie of andere mechanische schade, lange blootstelling aan lucht of zonlicht, en bevriezing kunnen leiden tot artefacten. Knip van ten minste vijf 3-4 mm dikke stukken van lever uit verschillende regio’s en in de kleefpoeders container plaatsen. Omvatten de normale en abnormale gebieden, indien waargenomen. Afhankelijk van grootte, een hele gonaden of meerdere stukken langs één gonaden in de kleefpoeders container te plaatsen. Hele organen, als kleine of stukken van alle andere organen (milt, anterior en posterior nier, kieuwen, hart, darm en maag) plaats in de kleefpoeders container. Als abnormale weefsel wordt waargenomen, behouden een aangrenzende stukje normale weefsel zo goed. 4. Verwijder de Otolieten voor leeftijd Analyses Opmerking: Leeftijd kunnen een belangrijke variabele in vis ziekte/vis gezondheidsstudies. Terwijl een aantal structuren, met inbegrip van schalen en stekels, zijn gebruikt voor leeftijdsbepaling, hebben de meeste studies vergelijken structuren de Otolieten te geven de beste resultaten36,37gevonden. Teleost vissen hebben drie paar Otolieten – lapillus, sagitta en asteriscus. In het algemeen worden de Sagittaal of lapillus Otolieten verzameld voor veroudering, hoewel dat per soort verschillen kan. Verwijdering en veroudering technieken geweest eerder beschreven38. Dwars door de landengte van gill, en buig het hoofd achterover. Strip weg bindweefsel en gespierd weefsel rond de lagere gedeelten van de neurocranium vinden prootic bullae, een verhoogde bony gebied. Score of snijden met been scharen en spleet om de Otolieten bloot te stellen. Zij kunnen worden gezien met het blote oog. Otolieten in een gelabelde flacon of een munt envelop en winkel bij kamertemperatuur totdat geanalyseerd voor leeftijd door het tellen van de ringen of stappen38plaatsen. Als plaatsen in een flesje, GLB eenmaal teruggekeerd naar het laboratorium open en laat grondig drogen vóór opslag. Figuur 5 : Verwijdering van Otolieten. (A) de landengte wordt gesneden en het bindweefsel en de spieren trok weg om de basis van de wervelkolom en neurospinal gebied bloot te stellen. (B) het bot is gekraakt om de Otolieten bloot te stellen. (C) Lapillar Otolieten worden verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 5. het verkrijgen van weefsel voor Immune functie Assays Opmerking: De anterior nier is de grote hematopoietische orgel, de bron van lymfocyten en macrofagen voor functionele tests, en moet aseptisch worden verwijderd als cellen zal worden gekweekt voor de functionele testen, zoals mitogenesis, fagocytische en doden vermogen van macrofagen39,40. Spray het buitenoppervlak van de vis met 70% ethanol. Steriele schaar, scalpel en pincet gebruiken om te openen de buikholte en verwijderen van de voorste nierweefsel, die een donker rode orgaan gelegen anterior to de zwemblaas is. Leg het anterior nier monster in media (bijvoorbeeld Leibovitz L-15) de cellen om levend te houden. Meng nier monsters met een steriele hand-held weefsel slijper (bijvoorbeeld Tenbroeck weefsel grinder) in één cel schorsingen. Houd op nat ijs totdat keerde terug naar het laboratorium. 6. het behoud van weefsel voor nucleïnezuur Analyses Opmerking: Als downstream moleculaire analyse zal plaatsvinden, zoals genexpressie via transcript overvloed41 of kwantitatieve PCR42 (polymerasekettingreactie), leg de stukjes weefsel te worden beoordeeld in een geschikt conserveringsmiddel ( bijvoorbeeld, RNAlater stabilisatie oplossing) zo spoedig mogelijk. Voor behoud van RNA, twee tot drie kleine (2-3 mm) stukken in de juiste conserveringsmiddel op een 10:1-verhouding van conserveermiddel volume aan weefsel te plaatsen.Opmerking: Monsters moeten worden afgeschermd van zonlicht of extreme hitte en vervoerd op nat ijs. Voor behoud van DNA, plaatst u twee tot drie kleine stukjes weefsel in 95% ethanol (10:1 ethanol aan weefsel volumeprocent). Houd vervolgens de monsters op nat ijs en sla bij-20 ° C.

Representative Results

Gebieden van zorg (AOC) van de grote meren zijn geografische gebieden die werden aangewezen als gevolg van afboekingen van diverse nuttige toepassingen. Een van de vruchten afboekingen (BUIs) op vele AOC is de vis tumoren of andere misvormingen. Miljoenen dollars zijn besteed voor sanering en herstel van elk van deze gebieden om de verschillende BUIs en uiteindelijk de AOC43schrapping uit een noteringslijst. De criteria voor de schrapping uit een noteringslijst de vis tumor die bui verschilt van staat tot staat (Zie epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf en dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); zoals opgemerkt in de delisting documenten, is er echter een vereiste om te bepalen van de prevalentie van lever tumoren, en in sommige gevallen huid-tumoren. In veel gevallen wordt de prevalentie vergeleken met een niet-AOC referentiesite. De vis tumor BUI werd geëvalueerd op drie AOCs (St. Louis River, Milwaukee rivier en Sheboygan River) en een niet-AOC referentiesite (Kewaunee rivier) op meren Superior en Michigan, met behulp van een necropsie gebaseerde beoordeling van witte zuignap (Catostomus commersonii ), gevolgd door microscopische pathologie van de huid en leverweefsel. Vissen werden verzameld uit de Milwaukee, Sheboygan en Kewaunee rivieren in 2012 en 201344 en de St. Louis River in 2015 (niet-gepubliceerde gegevens). Twee honderd witte zuignappen zijn beoordeeld uit Milwaukee, Kewaunee en St. Louis en 193 van Sheboygan. Per definitie kunnen een tumor een zwelling of verhoogde gebied, hoewel het wordt algemeen beschouwd als dat een zwelling veroorzaakt door een abnormale groei van weefsel met abnormale cellen een goedaardige of kwaadaardige gezwellen is. Witte sucker verzameld uit alle sites tentoongesteld een verscheidenheid van externe verhoogde letsels, met inbegrip van kleine, discrete witte vlekken, grotere witte gebieden, lichtjes opgeheven mucoid laesies en multilobed verhoogde gebieden op het lichaamsoppervlak en de lippen (Figuur 6). Vissen werden gewogen en gemeten om te verkrijgen van de factor van een voorwaarde, externe en interne afwijkingen werden gedocumenteerd en huid en lever weefsel werd verzameld voor histopathologisch onderzoek. Figuur 6 : Verhoogde huidletsels waargenomen op witte uitloper van de grote meren. (A) een discrete witte vlek op het lichaamsoppervlak. Schaal bar = 5 mm. (B) een iets verhoogd slijmachtig (pijlen) en multilobed letsels (a) op de achterste lichaamsoppervlak. Schaal bar = 1 cm. (C) A large, multilobed laesie op het lichaamsoppervlak. Schaal bar = 1 cm. (D) tal multi Gelobde laesies op de lippen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Het percentage van vis met externe tumoren of verhoogde verkleurd gebieden varieerden van 15,5% op het AOC van St. Louis naar 58.0% op de Milwaukee AOC. In het algemeen, waren de discrete witte vlekken de minst voorkomende visuele laesie, terwijl de multilobed lip en lichaam oppervlakte letsels meest voorkomende waren. Het aantal vissen met waarneembare lever knobbeltjes was laag, variërend van 1,5% bij Kewaunee en St. Louis tot 2,5% in Milwaukee (tabel 1). Rivieren en jaar bemonsterd Zichtbare laesies Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Discrete witte vlekken 16 3 3.1 5 Slijmachtig 20 9.5 9.8 30,5 Multilobed 22,5 3 29,5 40 Totaal verhoogd huid afwijkingeneen 46 15,5 38,3 58 Zichtbaar lever knobbeltjes 1.5 1.5 1.6 2.5 een Totale aantal vissen met verhoogde laesies. Sommige vissen had meerdere soorten afwijkingen. Tabel 1: Necropsie gebaseerde waarnemingen van witte Sucker verzameld op het gebied van de grote meren van bezorgdheid en een referentiesite (Kewaunee rivier), gepresenteerd als een Percentage.Visueel onderzoek kan worden gebruikt voor het documenteren van het percentage van vis met verschillende afwijkingen. Echter om te diagnosticeren definitief de aanwezigheid en soort neoplasie, weefsels moeten worden onderzocht microscopisch (histopathologisch onderzoek). Bij microscopisch onderzoek bleek dat niet alle van de verhoogde laesies neoplastische waren. Veel van de discrete witte vlekken en de mucoid laesies, met name op Kewaunee, waren hyperplastische laesies in plaats van neoplasie (tabel 2). Bovendien, op Kewaunee en St. Louis waren alle van de tumoren van de huid waargenomen goedaardige papillomas. Sheboygan en Milwaukee werden papillomas zowel squamous cel carcinomen, kwaadaardige huid-tumoren, waargenomen (tabel 2). Rivieren bemonsterd Neoplasm Type Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Papilloma 21 5.2 30,5 37,5 Plaveiselcelcarcinoom 0 0 2.1 10.5 Totale huid gezwellen 21 5.2 32,6 48 Gal duct gezwelleneen 2.5 4 6.2 9.5 Hepatische cel gezwellenb 1 0 2.1 8 Totaal lever gezwellen 3.5 4 8.3 15,0-inchc een Omvat cholangioma en cholangiocarcinoma b Omvat hepatische cel adenoom en hepatische cel carcinoom c Sommige vissen had gal duct zowel hepatische gezwellen Tabel 2: Microscopisch gecontroleerd neoplastische laesies van witte Sucker verzameld op het gebied van de grote meren van bezorgdheid en een referentiesite (Kewaunee rivier), gepresenteerd als een Percentage.De histopathologische analyse ook geïdentificeerd lever tumoren die niet werden geïdentificeerd door visuele waarneming. Terwijl slechts 1,5% van de vis geïncasseerd via Kewaunee en St. Louis had zichtbaar lever knobbeltjes (tabel 1), had 3,5% en de 4,0%, respectievelijk, microscopisch geïdentificeerd gezwellen (tabel 2). Een groter verschil werd gezien op de Sheboygan (1,6% versus 8,3% microscopische zichtbaar) en Milwaukee (2.5% versus 15,0% microscopische zichtbaar). Microscopisch onderzoek biedt ook een differentiatie van gezwellen van gal duct versus hepatische cel oorsprong (tabel 2) en goedaardige versus kwaadaardige tumoren.

Discussion

De necropsie gebaseerde beoordeling van de gezondheid van de vis kan worden gebruikt op alle vissoorten waarvoor de onderzoeker een goed begrip van de normale weergave van zowel de externe als de interne structuren heeft. Met behulp van een gestandaardiseerde aanpak zorgt voor vergelijkingen tussen sites en soorten evenals seizoensgebonden en temporele veranderingen in een populatie. De bevindingen kunnen effecten geassocieerd met point- and -nonpoint bronnen van verontreinigende stoffen te kunnen identificeren en te informeren van de beheersmaatregelen worden gebruikt. Het kan ook worden gebruikt voor het bijhouden van verbeteringen zodra beheersmaatregelen worden geïnitieerd. De methodologie kan als aanvulling op de documentatie van visuele externe afwijkingen op een aantal manieren worden gewijzigd. Evaluaties, alleen gebaseerd op visuele waarnemingen, kunnen niet-dodelijke, relatief goedkoop en gegevens kunnen snel worden gegenereerd voor een groot aantal personen. Daarom kunnen zij nuttig voor oriënterende of eerste evaluaties, om te controleren wijziging na verloop van tijd of in combinatie met andere indicatoren. Als de lengte en het gewicht van de vissen worden gemeten tijdens de visuele waarnemingen, kan ook de voorwaarde factor te worden berekend. Hoewel de evaluatie alleen gebaseerd op visuele waarneming geven geen informatie over oorzaak of bijbehorende risicofactoren, lange termijn trends van bepaalde huid afwijkingen45 en biometrische parameters46 hebben aangegeven verbetering op sommige gebieden in verband met de verbetering van de kwaliteit van het water.

De necropsie gebaseerde beoordeling biedt meer informatie zoals interne organen ook onderzocht worden en andere voorwaarde factoren zoals hepatosomatische index en gonadosomatic index kunnen worden berekend. Goede en Barton22 ontwikkelde een veld necropsie-methode die bloedparameters, biometrische factoren, het percentage van de afwijkingen en indexwaarden voor specifieke afwijkingen opgenomen. Een verfijning van de methode opgenomen een prioriteitsniveau voor sommige variabelen die toegestaan voor de berekening van een evaluatie-gezondheidsindex die kan worden vergeleken statistisch23. Deze beoordeling van de gezondheidsindex is gebruikt in de regionale site vergelijkingen23,47,48 en in combinatie met andere biologische indicatoren, met inbegrip van plasma en histopathologische analyses in de VS geologische Enquête de Biomonitoring van de milieutoestand en Trends programma evalueren van potentiële effecten van blootstelling aan verontreinigingen in grote rivieren landelijk49,50,51. Een vis ziekte Index gebaseerd op uitwendig ziekten en parasieten, zichtbaar lever gezwellen en andere histopathologically gedetecteerd lever laesies heeft ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in de Noordzee, Oostzee, en uit IJsland. Deze index bleek te zijn een belangrijk instrument als een ecosysteem gezondheid indicator52.

Er zijn een aantal kritische factoren in de beoordeling van de necropsie gebaseerde op vis. Ten eerste moeten evaluaties plaatsvinden op vis onmiddellijk na de dood. Wijzigingen in orgel kleur en consistentie kunnen vrij snel optreden na dood. Bovendien kunnen sommige parasieten de host laat spoedig na de dood. Ten tweede, is het belangrijk om te weten wat is normaal voor de soorten van belang. Bijvoorbeeld, sommige vissen hebben doorgaans vette en bijgevolg verbleken levers, terwijl voor de meeste soorten zou een bleke lever abnormale. Het is ook belangrijk om te erkennen van de seizoensgebonden veranderingen die van nature voorkomen. Sommige vissen zal kleurwijzigingen hebben of ontwikkelen van fokken tubercles tijdens de paaitijd.

De beperkingen van de necropsie gebaseerde beoordeling als een methode voor de beoordeling van de gezondheid van de vis onder meer het onvermogen om 1) consequent identificeren de “oorzaak” van specifieke letsels en 2) het identificeren van effecten die mogelijk niet zichtbaar met het blote oog. Deze nadelen kunnen worden overwonnen met de toevoeging van Histopathologie, moleculaire of culturele identificatie van ziekteverwekkers en parasieten en genexpressie. Bijvoorbeeld, een “tumor” of verhoogde laesie (zwelling) kan werkelijke neoplasie of het kan een parasiet, ontsteking, oedeem of hyperplasie (toename aantal normale cellen), veroorzaakt door blootstelling aan chemische stoffen, infectieuze agentia of andere irriterende stoffen. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, vereist definitieve tumor of neoplasie diagnose microscopische pathologie te identificeren van de laesie type en de ernst (dat wil zeggen, goedaardige of kwaadaardige). Beoordeling van externe witte sucker “tumoren” door visuele waarneming overschat de prevalentie, met name op de referentie-site. Veel van de verhoogde laesies waren niet gezwellen maar eerder hyperplastische laesies. Het is momenteel niet bekend of deze hyperplastische letsels vooraf neoplastische zijn. Omgekeerd, de waarneming van verhoogd knobbeltjes in de lever aanzienlijk onderschat de prevalentie van lever gezwellen. Vandaar, verzameling van weefsel voor microscopisch pathologie was noodzakelijk om het potentieel voor de schrapping uit een noteringslijst adequaat te behandelen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door het U.S. Geological Survey van ecosystemen (Chesapeake Bay omgevingen en visserij) en Milieuhygiëne (contaminanten biologie) programma’s en de West Virginia Department of Natural Resources. Gebruik van merknamen dient alleen ter identificatie en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

Materials

Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (in mm increments) Any
Battery powered scale (in gm) for fish weight Any
Battery powered scale (in mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 ml) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 ml syringes with 23 gauge needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2ml cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
  2. Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
  3. Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" – eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
  4. Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
  5. Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
  6. Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
  7. Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
  8. Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
  9. Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
  10. Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
  11. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
  12. Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
  13. Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
  14. Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
  15. Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
  16. Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
  17. Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T., Simon, I. n. T. P. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. , 225-246 (1999).
  18. Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
  19. Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
  20. Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
  21. Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
  22. Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
  23. Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
  24. Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
  25. Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
  26. . American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , (2004).
  27. Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. . Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , (2009).
  28. Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. . Fisheries Techniques, third edition. , 1009 (2013).
  29. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
  30. Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
  31. Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film – a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
  32. Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
  33. Kane, A. S. . Descriptive guide to observing fish lesions. , (2005).
  34. Rafferty, S. D., Grazio, J. . Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , (2018).
  35. . European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , (2018).
  36. Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
  37. Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
  38. Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H., Stevenson, D. K., Campana, S. E. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. 117, 19-57 (1992).
  39. Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5′-bromo-2′-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
  40. Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
  41. Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology – Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
  42. Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
  43. Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
  44. Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
  45. Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
  46. Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality – data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
  47. Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
  48. Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
  49. Blazer, V. S., Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. , 18-21 (2000).
  50. Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
  51. Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
  52. Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).

Tags

NecropsyWild Fish Health AssessmentFish HealthStressorsAbnormalitiesBlood CollectionHistopathologyOtolithImmune FunctionGene ExpressionStandardized EvaluationFish Necropsy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image