Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

ここで説明したすべての実験は、1986 年の英国動物 (科学的なプロシージャ) の行為に含まれているガイドラインに従って行われ、女王のベルファストの大学動物の福祉と倫理的な調査機関によって承認されました。 1. 網膜細動脈の分離 メモ: 次のプロトコルは、網膜細動脈を分離する使用されます。このメソッドは、ラット網膜細動脈の最適化されますが、マウスの網膜で使用することができます。ただし、船舶の収量は低くマウスを使用する場合です。 低 Ca2 +ハンクス (LCH) を含む表 1に示すように、ソリューションを構成します。注意: このソリューションが 4 ° C で最大 3 日間保存することができます (LCH を保存を使用するときことを確認それは部屋の温度にある pH が使用する前に正しい)。 網膜の急速なレーザーマイクロダイ セクションを確保するための組織のコレクションの前に次の機器を組み立てる: 曲線はさみ、解剖皿 (ペトリ皿をシリコン コーティング)、単一研がれた刃鉗子、鉗子 (鈍) 1 杯の 2 セットを鋸歯状パスツール ピペット(火がスムーズにない狭い先端にポリッシュ)、1 の使い捨てプラスチック ピペット (先端に開口部を増やすをオフにトリミング 〜 5-7 mm)、1 ガラス丸底テスト チューブ (5 mL) とホルダー。LCH のガラス ビーカーに約 50 mL をデカントし、廃棄物の流体をデカントする 2 番目のビーカーを準備します。注: は、仕様および製造元の詳細テーブルの材料を参照してください。 Exsanguinate に続いて心臓穿刺 CO2を使用してラットを安楽死させる (と目の血管に損傷を与える可能性がありますこれらは頚部転位や脳震盪を避ける)。鋸歯鉗子でまぶたを撤回し、軌道の筋肉の周りと視神経をカットする曲線はさみを使用します。優しく世話をハサミで残り添付ファイルをカットする軌道から目を抽出します。 (必要に応じて、目は LCH の溶液に氷の上も転送できる) 解剖皿の上の LCH ソリューションに没頭して目を配置します。軌道筋肉の添付ファイルまたは視神経を伝って料理に目を固定するのに 1 セットの鈍い鉗子を使用します。アンカー ポイントが目を安定させるために強膜にできるだけ近くあるを確認します。 ブレードを使用すると、鋸状縁に沿って角膜を切って、鉗子で強膜の軽く、レンズを取り外します。 視神経乳頭を対称的に半分にアイカップをカットします。使用鉗子閉鎖優しく世話を視神経乳頭で残り添付ファイルを削除するアイカップの 2 つの半分から網膜を ‘ ブラシ’。2 番目の目とプロセスを繰り返すし、試験管を使用して LCH 媒体のプラスチック ピペットと小さな損失に切り裂かれた網膜を転送します。 LCH と試験管を埋めるプラスチック製のピペットを使用して 〜 5 mL ができ、底に沈殿する網膜。 削除することにより約 3 倍の組織を洗って 〜 4 mL チューブとプラスチックのピペットを使用して新鮮な LCH の追加のソリューション。必要に応じて、靱帯、硝子や毛などの余分な組織を削除します。 ガラス ピペットへのこだわりから、組織を防ぐために LCH のパスツール ピペット (洗練されたチップ) の内側を洗います。同じピペットを使用して、試験管から約 4 mL の溶液を取り外します。新鮮な LCH の約 2 mL を加えます。 優しく分離 (カップ刻んだ) ガラスの先端から組織を描画することによって網膜ゆっくりピペット、試験管の中に内容を排出します。注意してください、この段階で気泡を導入しないように。 ステップは 1.10 を繰り返して、網膜が約 2 〜 3 mm2のサイズに分割されます。 LCH の約 2 ml ピペットの内部を洗浄し、試験管の中にこれを追放します。5-10 分以上の底に沈殿する内容が許可します。 組織部分が約 1 mm2のサイズになるまで、もう少しの力で 1.10 1.12 で説明したように、製粉プロセスを繰り返します。もう一度、5-10 分のために解決する組織を許可します。 内容は完全に均質化し、網膜の部分が残っていないまで、3 分の 1 が時間より多くの力手順 1.10 1.12 (ソリューションでは外観が乳白色になる必要があります)。注: この方法が得られるまで 8 arteriolare セグメント (周囲の構造といくつかの枝は、そのまま残り比較的自由) 8-45 μ m 径と 200-2500 μ m の長さの測定の独立性あたり。 生理学的記録室に分離株の少量を転送または細胞内 Ca2 +濃度 ([Ca2 +]i; セクション 3 を参照) の測定用蛍光染料を追加します。目のカップや動物の廃棄物の取り扱いに関するローカル ルールに従って分離プロセス中に削除されたソリューションの残骸の処分します。メモ: 分離後すぐに船で実験することをお勧めですが、余剰の分離は 8 h まで 4 ° C で保存できます。 2. 細動脈圧図法 注: 動脈圧図法次のように図 1 a、 Bおよび材料の表に詳細な機器を使用して実行されます。 網膜血管ホモジネートの因数を転送 (1-2 mL のセクション 1 に従って分離) 生理学的記録室に (部分的に満ちて名目上 Ca2 +無料ハンクス液; 0Ca2 +ハンクスの表 1を参照) のステージ上にセット、倒立顕微鏡。実験の前に少なくとも 5 分記録室の下解決する船を残します。 視覚的に細動脈 > 200 μ m の長さと、容器を cannulated できるオープン エンドを所持を識別するために記録室全体スキャン (容器の種類の同定はさらに検討結果セクションで)。ビューのフィールドの中央に容器を置きます。適当な容器が存在しない場合は、手順 2.1 に従って記録室に磨砕液容器のもう一つの因数を転送します。 微細鉗子と小さなタングステン ワイヤのスリップを使用して容器の一方の端をアンカー (75 μ m 径と 〜 長さ 2-4 mm)、容器の上に配置 (図 1(i) を参照してください)。これを行う鉗子のワイヤーを保持し、記録室上鉗子を探します。 ワイヤーが明らかになるまで風呂に鉗子を下げる、顕微鏡下で鉗子の対応するシャドウを識別します。開放端から船約 200 μ m のワイヤーを配置し、容器の長軸に垂直な線をドロップします。注: タングステン線の重量は遠位挿管および加圧中に内容の流れを停止する血管を閉塞するのに十分です。 加圧カニューレに沿ってオープン エンドとお風呂で水平になるように記録室内の適切な位置に、細動脈を移動 (図 1(ii 〜 iv) を参照してください)。優しく鉗子; 内で開催されたワイヤーの追加セクションで遮蔽タングステン ワイヤー スリップを微調整してください。鉗子に不可逆的準拠として、細動脈を触れないでください。 容器の閉塞と開放端の間の距離が以上 200 μ m になるよう (長い細動脈セグメント) のため必要に応じてを追加、船追加タングステン ワイヤー スリップこれは、加圧時の視野の外に移動する細動脈を防ぐのに役立ちます。船に任意の側枝がある場合これらも追加タングステン ワイヤー スリップを閉塞する必要があります.側枝を閉塞できない場合は、容器を破棄します。 0Ca2 +ハンクス余分な網膜組織を削除し、生理的温度にお風呂を暖かく 37 ° C でチャンバーを灌流します。注: 標準重力供給風呂灌流およびインライン ヒーター システムは、この目的に使用することができます (図 1A参照)。2 +により、外部の Ca の削除以来残っている細動脈を拡張、0Ca2 +ハンクスの穿刺の手順を容易にするために使われます。 作製 filamented ホウケイ酸ガラス管 (cannulated する容器の直径に応じて先端直径 3 〜 10 μ m; 小型船の狭いカニューレが必要;材料の表を参照してください) から加圧カニューレを使用して、電極の引き手および 0Ca2 +ハンクス液で埋め戻す。カニューレのシャンクは、カニュレーションを容易にするために先端に向かって優しくテーパを確認します。 Y コネクタと 3 ウェイ タップ; を介して 10 mL 注射器、ピペット ホルダーにカニューレをマウントします。これを使用してシステムを加圧し、圧力を圧力計、他側アーム Y コネクタに接続されているを使用して記録されている (図 1B参照)。注: ‘ヘルパー’ ピペット穿刺プロセスを支援するために必要です。ホウケイ酸ガラス キャピラリー先端径 0.5 に電極の引き手を引いたからピペットを作製 – 2 μ m 大きく火災時のポーランド語使用、マイクロフォージ ピペット (多くの場合終了) まで。 慎重に移動してヘルパー ピペット容器の長軸に対して直角に近い 3 軸マニピュレーターを用いたオープン エンド (図 1を参照)。それは触れないではないが、船のすぐ上、ヘルパー ピペットを配置します。 容器の開口端カニュレーション ピペットの位置 (図 1および2 a(i) 参照) 微動マイクロマニピュレーター; を使用して(20 X) で顕微鏡の焦点の平面を調整することによって評価のように、先端開口部に隣接を置きます。カニュレーションのカニューレが正しく配置されて同時に容器とカニューレ先端末がフォーカスされているとき (図 2 a(ii) を参照してください)。 微動マイクロマニピュレーターの x 軸コントロールを使用して容器の開口部に加圧カニューレを進む (図 2 a(iii) を参照してください)。Y 軸に沿ってカニューレを移動することによってカテーテル留置の成功を評価します。カニューレが容器内に残っている場合、正常に ● キャニュレイテッド (図 2 a(iv) を参照) です。カニューレは船の上なりやすいカニューレは容器の外に移動する場合もしそうなら z 軸の下面にカニューレとステップ 2.10 2.11 を繰り返します。 成功カニュレーション時に、血管を抑制するため船にヘルパー ピペットをゆっくりと下ろします。細動脈の壁のガイド ヘルパー ピペットと加圧カニューレを介して同時にカニュレーション ピペットの先端に、さらに約 30-50 μ m の距離に血管内腔に (図 2 a(v, vi) を参照してください)。注: この手順必要があります両方のマニピュレーター (ヘルパー ピペット カニューレを血管内腔に移動しながらカニューレへの移動) の同時に制御された動きと高い成功率を達成するために広範な練習が必要です。 2 mM は Ca2 +を含む通常ハンクスにバス ソリューションを変更 (表 1参照) 37 ° C で通常これは、細動脈と加圧カニューレの周りタイトなシールの形成のわずかな縮小されます。ヘルパーのピペットは、船から移動できます。 15 分 USB カメラ (と画像集録ソフトウェア) を使用して船を顕微鏡と容器の境界、(を参照してください外部で管腔内のスペースの間のコントラストを最大限にフォーカスを調整するビューを開発するタイトなシールを許可します。図 2B)。0.5 – で船を画像 5 フレーム/秒。 加圧カニューレに接続されている 3 ウェイ タップを閉じることによって所望のレベルに内圧を増加 0 mmHg に記録の 1 分後 (図 1B参照) 注射器を介してシステムに肯定的な圧力の少量を適用します。圧力の圧力計の変動を観察します。メモ: 圧力を追加できます 100 mmHg までまたは 1 つの値のステップで賢明な方法で例えば 40 mmHg (生体内で網膜細動脈圧近似)23。容器は、カニュレーションの成功を確認する急速に広がるべきであります。注意してください、圧力誘起収縮 (すなわち、筋原性の応答)、その後 15 分の期間にわたって開発が、これらの血管のサイズが小さいためこれが常に視覚的に検出されません。 慎重に明白なリークの初期加圧中船を監視します。リークのソースは、細動脈の内側に劈開側枝やカニューレの不十分なシールから起きる可能性があります。 船を残して腔内容を監視します。小さくより少なく明らかな漏れは圧力計圧力の低下につれて明らかになる可能性があります。可能であれば、カニューレを邪魔しないように世話その他タングステン ワイヤー スリップと開口部が閉塞してしまったり。さらに分析から明らかな漏れ準備を除外します。 前に、容器または (前者、後者の効果の分析が可能に決定する筋音の発達に及ぼす影響実験の目的に応じて 15 分加圧、次に関心 abluminally の薬を適用します。定常状態の筋トーン)。典型的なドラッグデリバリー システムは、図 3 aの写真です。 距離で (図 1で示されている) として配信アウトレット関心の船の部分に垂直の位置 〜 500 μ m 確保に留意し関心の船から、コンセントが最適角度を完全に superfuse エリア (を参照してください図 3B)。血流の変化が物理的に船を邪魔しないでことを確認します。 実験が完了した後、パッシブの直径を決定するための容器を最大限に拡張する 10 μ M ワートマンニン (ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤) を含む 0Ca2 +ハンクスのソリューションを適用します。注: カニュレーション シールの強度テストされる実験の結論に内圧を上げることによって > 100 mmHg。船舶の大半もタイトなシールを示すこの高圧で接続されているままになります。 エッジ検出を使用して細動脈径の変化を追跡するオフライン分析を行う (推奨するソフトウェアの材料表を参照してください)。容器間比較のため受動的な直径に細動脈径を正規化します。 3. Ca2 +イメージング 注: 孤立した網膜細動脈が従来 (microfluorimetry) の準備し、共焦点 Ca2 +イメージングとして (材料の表に詳細な機器を使用して) 次のましょう。 セクション 1 で説明したよう、5 mL のガラス試験管に網膜のホモジネートを準備します。網膜の磨砕液の 1 mL に 5 μ M の最終的な集中を与える Fura 2 (microfluormetric Ca2 +記録) または蛍光-4 (共焦点 Ca2 +イメージング) を追加 (光から保護する);平滑筋細胞に色素インジケーターを優先的に読み込みます。 網膜組織を再停止する 15-20 毎分 2 h 管の側をフリック、暗所に室温で維持します。その後、染料のローディングを減らすために LCH ソリューションと磨砕液 1:4 希釈します。注: 血管まで 6 時間 (4 ° C で、暗闇の中に格納されている) 場合。 実行可能なままただし内部器官の色素の区分や時間の経過とともに色素の押出の影響を減らすために、できるだけ早く実験を開始をお勧めします。 1-2 mL の網膜の磨砕液をガラス底記録室 (LCH で満たされて) Ca2 + microfluorimetry または共焦点顕微鏡システムに接続されている倒立顕微鏡のステージ上にセットに転送します。 間隔タングステン ワイヤー スリップ (50 μ m 径、長さ 2-4 mm) を記録室に細動脈の流れの方向に垂直のアンカー 〜 100-200 μ m の容器の長さに沿って間隔 (図 3を参照) で説明した同様の手法を使用して2.3 をステップします。 37 ° C で通常 Ca2 +ハンクス液と一緒にお風呂を灌流します。図 3に示すよう薬配信アウトレットを置き、2.17 の手順で説明するように、薬を船舶に適用します。 従来 Ca2 +イメージング、油浸漬 UV 目的 (例えば100 X、NA 1.3) を介して 340/380 nm の光の容器を照らすし、510 で放出される蛍光の収集を介してフォトンカウンティング光電子増倍管 (PMT) nm。 各実験の最後に、焼入れ MnCl 含有溶液の容器によるバック グラウンド蛍光を測定 (表 1参照)。バック グラウンド補正蛍光比 (R-F340/F380) を使用して、分析や細胞内の Ca2 + ([Ca2 +]i) 使用する変換 R分と R最大測定 (表 1 参照;を焼入する前に適用24) と Grynkiewicz 式25。 共焦点 Ca2 +イメージング、励起蛍光 4 ロード船、488 nm 帯およびキャプチャ 490 535 nm 行のいずれかの結果として生じる蛍光排出量スキャン モード (xt) または xyt スキャン モード (512 x 512 ピクセル; 推奨ピンホール 300 nm)。正規化時間 t で記録された蛍光測定 = 0 (0F)。医薬品申請または加圧オフライン特定の地域で関心 (ROIs) の画像解析ソフトを使用中に [Ca2 +]iの変更を評価します。 必要な場合は、圧力図法による Ca2 +イメージングを実行します。注: 上記の説明は、非与圧部血管に最適化されていますしかし Ca2 +イメージング図法の圧力で次のように組み合わせることが可能です。 セクション 1 に従って細動脈を分離します。3.1 3.2 の手順に従って Ca2 +インジケーター染料とともにロードします。記録室に細動脈を転送し、セクション 2 に従って cannulate。取付手順中にライトへの露出を制限するため注意してください。 Ca2 + 3.5 または 3.7 上記手順に従って測定します。容器を加圧し、Ca2 +.の測定を繰り返す血管径の計測は Ca2 +測定器具使用のモードによって異なります。注: 共焦点 Ca2 +測定の必要があります光に長時間露光中に色素の漂白のため画像別々 の領域前後加圧します。 4. パッチ ・ クランプの電気生理 注: 個々 の細動脈平滑筋細胞の静止 (材料の表に詳細な機器を使用して) 次のように、親動脈に埋め込まれたから全細胞および単一チャネル記録が可能です。 切り分け、録音室で網膜細動脈のアンカー 1、2.3、および 3.3 の手順で説明するようします。パッチ ・ クランプ記録のスリップはタングステン線は血管に沿って 200 800 μ m 離れてを等間隔しました。 基底膜、血管の周囲を外し、電気に隣接する平滑筋細胞とパッチ前に基になる血管内皮細胞を切り離します。これを行うに superfuse 必須の持続期間のための 37 ° C で酵素液 (表 1) の一連の容器。注: 酵素露出の持続期間はラット網膜細動脈に最適です (プロテアーゼ、~ 8 分; コラゲナーゼ、~ 12 分) と薬物送達システム (私たちの設定 〜 1 mL/分) の流量と使用されている酵素のバッチのユニット活動に依存します。 消化の内皮の視覚分離のレベルを評価し、コラゲナーゼの中に平滑筋層は、図 4に示すようにステップします。(図 4 bに示すように)、細胞層の分離が見られる適用 DNAse 私ソリューション (~ 4 分) 入浴液の通常 Ca2 +ハンクスの差し替えにより消化を終了します。 慎重に容器の表面に沿って微細鉗子の閉じたヒントをスイープすることにより基底膜および/または末梢神経網の任意の残りの繊維を削除します。 引っ張るとガラス管 (資材表)、ピペット ソリューション (表 1) の塗りつぶしを磨くし、パッチ ・ クランプ パッチアンプ用アダプターのピペット ホルダーにしっかりと配置。記録室に関連して 45 ° の角度でピペットを置き、電動マイクロマニピュレーターを荒い設定を使用して船に向かって前進します。 血管壁から突き出ている平滑筋細胞を選択し、その表面は目に見える物から無料 (図 4 bを参照してください)。徐々 に、マイクロマニピュレーターの罰金/遅い動きを使用して興味のセル上パッチ ピペットの先端を垂直方向に位置を上下平滑筋膜との接触。 細胞と細胞運動と集録ソフトウェアの膜 (シール) テスト プロトコルを用いてピペット抵抗の変化から視覚的にピペットの接触を評価 (5-10 mV 負のステップ 0 から mV、周波数 25 KHz; を参照してください図 5 a(i)). シール抵抗が 5 倍に増加しているとき (例えば、 2 から 10 MΩ; に上昇図 5A(ii)) y コネクタ、3 ウェイ タップ、シリンジ、ピペット ホルダーに接続されているチューブを介してピペット ホルダーの裏側に一過性否定的な圧力を適用する。 (細動脈の加圧で用いられている同様の方法で組み立て、図 1 bを参照)。 負圧の応用を繰り返して、gigaseal (> 1 GΩ 抵抗; 集録ソフトウェアで膜テストによって示される) が (図 5 a(iii)) を形成しました。1-5 分かかることがありますに注意してください。フォームに、gigaseal が失敗した場合は、パッチク ランプ新鮮なパッチ ピペットを使用する別のセルを選択します。 行われている実験 (通常 0、-40 または-80 mV) に従って取得ソフトウェアを介した細胞に潜在的な保持を適用されます。 現在の構成の研究 (セル) 単一チャネル活動。また、gigaseal 形成後細胞表面からパッチ ピペットを急速に後退してインサイド アウト パッチを生成します。 膜の空いている端点することができますこれらの条件の下で再アニーリングとマニピュレーター (粗設定) の急速な上下運動で風呂からピペットを削除します。ピペット チップ内部のパッチのみを残して改良された膜を削除する半月板を介して急速に返します。 サンプリング周波数を 5 KHz に集録ソフトウェアの設定、記録チャンネル活動に連続記録モードをアクティブにします。ソフトウェアまたはアンプ経由で必要な場合は、電圧変更を適用します。 必要であれば、2.17 の手順の説明に従って、薬を容器/膜パッチに適用します。 膜のストレッチが必要な場合、3 ウェイ タップや y コネクタを介して圧力計に接続されている注射器を用いたピペットの後方に負圧を適用されます。 開いている確率と標準手順26に従ってユニタリ コンダクタンスの単一チャンネル録音を分析します。 全体セル現在記録材料の表に従ってプルとポーランドのピペット、ピペット溶液アムホテリシン B と記入 (DMSO の 50 μ L にアムホテリシン B の 3 mg を追加、全細胞ピペット溶液 1 mL にこれの 3-6 μ L を追加; ミックスする超音波)4.6 4.9 の手順に従ってシールを形成します。 アムホテリシン B の包含のため全体のセルへのアクセスを得るためにピペット チップ内膜を破壊する必要はありません。集録ソフトウェアにおける膜テスト プロトコルの使用を徐々 に得て、アクセスを監視 (-40 から-20 mV ステップ mV、サンプル周波数 25 KHz; を参照してください図 5 b)。 いくつかのソフトウェアの容量の過渡現象の自動フィッティング アクセス抵抗 (またはトランジェントの相対的な衰退を目で評価する) セル キャパシタンスのリアルタイム測定値が得られます。アクセス抵抗 < 15 MΩ になると、一度シリーズ抵抗補償 (図 5) アンプの全体セル パラメーター ダイヤル (容量や直列抵抗) を使用してを実行します。 これを行うには、自動当てはめ値を使用して (図 5(ii) 参照) ダイヤルの初期設定し、シリーズ抵抗補正ダイヤル (予測と補正アンプの使用可能な場合) を増やすセル全体補償を再調整静電容量の過渡を削減しながら (図 5(iii) を参照してください)。 世話を補償 (図 5(iv) に示すように) とします。通常、穿孔パッチ モード (最大設定するラグ補償が必要) で 75% の直列抵抗を補償することが可能です。 自動継手が使用できない場合は、全体セル パラメーター 15 pF と 15 mΩ (これらの細胞は典型的な値) にダイヤルし、図 5(ii) に示すように、出力を生成する調整の設定によって開始します。シリーズ抵抗の補正ダイヤルは 〜 75% を増加し、図 5(iii) に従って全体セル パラメーター ダイヤルを再調整。 実験を開始する前に手動補正後のセルの容量測定初期の自動フィッティングからまたはダイヤルからに注意してください。注: この値は、セル サイズに電流を正常化する使用されます。直列抵抗の補償は、アクセス可能性がありますさらにパッチにアムホテリシン B の定款により向上するのにつれ、実験中に調整する必要があります。 2.17 の手順で説明するように、薬を船舶に適用します。実験的要件に従って電圧プロトコル (手順またはランプ) を適用します。注: 標準電圧ステップ プロトコル、0.1 – 1 期間、開催から適用されます 10-20 mV の電位をインクリメント電圧アクティブ電流の家族を生成するすべての 5-10 s。またゆっくりと電圧を変化させることによって 1 つ ‘掃引’ における電圧のシリーズで電流を測定するランプ プロトコルを使用 (100-200 mV/秒) から例えば+80 に-80 mV (すべて 5-10 s を適用) ランプの中に 10 mV 間隔で電流のサンプリングをオフラインで。 パッチ ・ クランプ記録通りで Ca2 +イメージングを組み合わせることが可能です。セクション 1 に従って細動脈を分離します。3.1 3.2 の手順に従って Ca2 +インジケーター染料とともにロードします。セクション 4 に従って録音室でマウントします。これらの手順の中にライトへの露出を制限するため注意してください。注: これまでにされていない酵素分解過程中に基底膜と血管整合性の損失による圧力図法の研究とパッチ ・ クランプを組み合わせることが可能