Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene
Summary
ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.
Abstract
Senescência celular tem sido considerada um estado de detenção do crescimento irreversível após o esgotamento da capacidade proliferativa ou exposição a várias tensões. Estudos recentes têm estendido o papel da senescência celular para vários processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento, cicatrização de feridas, vigilância imunológica e disfunção do tecido relacionadas com a idade. Embora a detenção do ciclo celular é uma característica crítica da senescência celular, uma produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio intracelular aumento também foi demonstrada a desempenhar um papel importante na indução da senescência celular. Além disso, estudos recentes revelaram que células senescentes apresentam potente parácrina atividades em células e tecidos através de um fenótipo secretor associada a senescência (SASP) vizinhas. O acentuado aumento no interesse sobre estratégias terapêuticas contra senescência celular enfatiza a necessidade de uma compreensão precisa de mecanismos de senescência, incluindo ROS intracelular e a SASP. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar quantitativamente os níveis intracelulares de ROS durante a senescência celular H-Ras-induzido usando tintura fluorescente ROS-sensíveis e citometria de fluxo. Além disso, apresentamos técnicas sensíveis para a análise da indução da expressão de RNAm e secreção de fatores SASP. Esses protocolos podem ser aplicados a vários modelos de senescência celular.
Introduction
Mais de 50 anos atrás, Hayflick e Moorhead revelaram que as células normais entrem prisão de crescimento irreversível após o esgotamento do seu potencial proliferativa após um determinado número de divisões celulares1. Este fenómeno é agora conhecido como senescência replicative e acredita-se que correlaciona-se fortemente com o envelhecimento dos2. Embora a progressiva erosão dos telômeros é considerada das principais causas da senescência replicative, várias tensões celulares, tais como o DNA danos, ativação oncogênica e estresse oxidativo, têm sido relatados para induzir um outro tipo de senescência celular chamado de “senescência precoce” ou “senescência induzida por estresse”. Curiosamente, senescência prematura desempenha um papel de tumor-supressora potente sobre a ativação de oncogenes, tais como H-Ras e BRAF. Estudos de modelos de rato e tecidos humanos produziram fortes evidências que biomarcadores de senescência celular eram predominantemente presentes em lesões pré-malignas onde oncogênica Ras e BRAF são ativados, mas foram diminuídos em cânceres malignos que desenvolveu a partir Estas lesões3,4,5. Além de seu papel no envelhecimento e supressão de tumor, senescência celular tem demonstrada em estudos anteriores para jogar um papel em vários processos fisiológicos, incluindo a cicatrização de feridas, reparação tecidual, vigilância imunológica e desenvolvimento embrionário6.
Embora a prisão de crescimento tem sido estudado extensivamente como uma marca registrada da senescência celular7, um significativo corpo de evidência sugere que espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) também contribuem para a senescência celular8. A elevação dos níveis ROS durante vários tipos de senescência celular, incluindo replicative senescência e senescência induzida pelo oncogene (OIS), foi originalmente relatada há décadas9,10. Mais diretamente, tratamento exógeno com uma dose subletais de H2O2 induz a senescência11,12. A inibição de enzimas ROS-eliminação, tais como a SOD1, também provoca senescência prematura13. Em contraste, baixas condições de oxigênio ambiente e aumentando o atraso de eliminação de ROS o início da senescência10,14,15. Estes resultados indicam, sem dúvida, que ROS são importantes mediadores ou determinantes da indução da senescência celular. No entanto, como ROS contribuem para a indução da senescência celular e como ROS níveis são elevados durante a senescência celular requerem mais investigação.
Estudos recentes têm revelado que células senescentes têm atividades parácrina potente em células e tecidos através de uma de16,de SASP17vizinhas. No tecido envelhecido, células senescentes promovem relacionadas com o envelhecimento do tecido disfunções através de muitos caminhos através de SASP além uma autónoma depleção de células proliferativas. Vários fatores proinflammatory, tais como IL-6, IL-8, TGFβ e metaloproteinases de matriz (MMPs), secretado pelas células senescentes, causam disfunções relacionadas com o envelhecimento do tecido através do comprometimento da homeostase do tecido, destruição da arquitetura do tecido, senescência das células vizinhas e inflamação estéril18,19. No entanto, SASPs pode ter efeitos benéficos, dependendo do contexto biológico. Além disso, a natureza heterogenetic do SASPs depende do tipo de células senescentes e o estágio de célula, enfatizando a necessidade de investigação mais19.
Aqui, descrevemos técnicas baseadas em citometria rápidas e sensíveis para avaliar os níveis intracelulares de ROS durante OIS. Além disso, métodos de análise dos fatores SASP usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) e ELISA são introduzidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos métodos para monitorar níveis ROS intracelulares durante a senescência de H-Ras-induzida em WI-38 fibroblastos humanos normais. Níveis ROS intracelulares em células vivas podem ser medidos quantitativamente usando o reagente de célula-permeável DCF-DA e citometria de fluxo. Após absorção celular, DCF-DA é deacetilada por esterases intracelulares e, posteriormente, oxidada pela ROS para formar altamente fluorescente 2′, 7′-diclorofluoresceína (DCF). Fluorescência de DCF pode ser detectada p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (2015R1D1A1A01060839) (para Young Yeon Kim) e por uma bolsa de pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF), financiado pelo governo da Coreia (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887, n. º 2016R1A5A2007009) (para Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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