מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית
Summary
ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.
Abstract
הזדקנות ביולוגית הסלולר נחשב למצב של צמיחה בלתי הפיך מעצר על מיצוי של קיבולת המקדימות או חשיפה לחצים שונים. מחקרים שנעשו לאחרונה הרחיבו את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר לתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל פיתוח, ריפוי הפצע, מעקב המערכת החיסונית של תפקוד לקוי של רקמות הקשורות לגיל. למרות מחזור מעצר התא הוא סימן היכר קריטי של הזדקנות ביולוגית הסלולר, ייצור מינים (ROS) חמצן תגובתי תאיים מוגברת גם הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה גילה כי תאים senescent שהפגינו פעילויות paracrine חזק על השכן תאים ורקמות דרך פנוטיפ הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה (SASP). העלייה החדה אינטרס לגבי אסטרטגיות טיפוליות נגד הזדקנות ביולוגית הסלולר מדגיש את הצורך הבנה מדויקת של מנגנוני הזדקנות ביולוגית, לרבות ROS תאיים על SASP. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להערכת רמות ROS תאיים באופן כמותי במהלך ה-Ras-induced הסלולר הזדקנות ביולוגית באמצעות ROS רגיש הפלורסנט cytometry זרימה. בנוסף, אנחנו מציגים רגיש טכניקות לניתוח של אינדוקציה של mRNA הביטוי והפרשת גורמי SASP. פרוטוקולים אלה ניתן ליישם מודלים שונים של הזדקנות ביולוגית הסלולר.
Introduction
יותר מ 50 שנה, Hayflick ולמורהד גילה כי תאים נורמליים להיכנס צמיחה בלתי הפיך מעצר על מיצוי של הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מספר מסוים של חלוקות תאים1. תופעה זו נקראת עכשיו הזדקנות ביולוגית replicative, הוא האמין בחום לתאם עם הזדקנות organismal2. למרות הסחיפה פרוגרסיבי של טלומרים נחשב הגורם העיקרי replicative הזדקנות ביולוגית, מדגיש הסלולר השונות, כגון ה-DNA נזק, הפעלת oncogenic סטרס חמצוני, דווחו לזירוז סוג נוסף של הזדקנות ביולוגית הסלולר נקרא “הזדקנות ביולוגית מוקדמת” או “מפגינות הזדקנות ביולוגית”. מעניין, הזדקנות מוקדמת ביולוגית ממלאת תפקיד הגידול מדכאים חזק בעת ההפעלה של oncogenes כגון H-ראס BRAF. מחקרים של מודלים של העכבר, ברקמות אנושיות יצרו ראיות חזקות שהיו סמנים ביולוגיים של הזדקנות ביולוגית התא בעיקר קיימים נגעים premalignant שבו oncogenic Ras ו- BRAF מופעלים אך היו פחתה ב סרטן ממאיר שהתפתחה מתוך אלה נגעים3,4,5. מעבר להיותו הזדקנות, דיכוי הגידול, הזדקנות ביולוגית הסלולר הוכח במחקרים קודמים לשחק תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל ריפוי הפצע, רקמות תיקון, מעקב המערכת החיסונית של התפתחות6.
למרות הצמיחה מעצר נחקרה בהרחבה כמו סימן היכר של הזדקנות ביולוגית הסלולר7, גוף משמעותי של הראיות עולה שכי מינים חמצן תגובתי תאיים (ROS) תורם גם הזדקנות ביולוגית הסלולר8. העלאת רמות ROS במהלך סוגים שונים של הזדקנות ביולוגית הסלולר, כולל הזדקנות ביולוגית replicative ואונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית (OIS), דווח במקור לפני עשרות שנים9,10. יותר ישירות, טיפול אקסוגני עם מנה לא קטלני של H-2-O-2 גורם הזדקנות ביולוגית11,12. עיכוב של אנזימי ניקוי ROS, כגון SOD1, גם גורם הזדקנות מוקדמת ביולוגית13. לעומת זאת, נמוך חמצן הסביבה תנאים והגברת ROS הניקוי עיכוב תחילת הזדקנות ביולוגית10,14,15. תוצאות אלו ללא ספק מציינים כי ROS הם מתווכים חשובים או גורמים האינדוקציה הזדקנות ביולוגית הסלולר. עם זאת, איך ROS לתרום תנאי הגיוס של הזדקנות ביולוגית הסלולר, איך ROS רמות גבוהות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר לדרוש בהמשך החקירה.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו תאים senescent שיש פעילויות paracrine חזק על השכן תאים ורקמות עד16,SASP17. ברקמת בגילאי, תאים senescent לקדם רקמות הקשורות לגיל בתפקוד דרך שבילים רבים דרך SASP בנוסף דלדול האוטונומי של שגשוג תאים. גורמים proinflammatory שונים, כגון IL-6, IL-8, TGFβ ו- metalloproteinases מטריצה (MMPs), מופרש על ידי תאי senescent, גורמות בתפקוד רקמת הקשורות לגיל דרך ירידת ערך של רקמות הומאוסטזיס, הרס של רקמות אדריכלות, הזדקנות ביולוגית של התאים הסמוכים, דלקת סטרילית18,19. עם זאת, SASPs יכול להיות השפעות מועילות בהתאם להקשר הביולוגי. בנוסף, הטבע heterogenetic של SASPs תלויה בסוג התא senescent ואת השלב תא, מדגישים את הצורך בהמשך המחקר19.
כאן, אנו מתארים מהיר ורגיש cytometry טכניקות מבוססות להערכת רמות ROS תאיים במהלך OIS. בנוסף, הציג שיטות לניתוח של גורמים SASP באמצעות כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) ואליסה.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, הוצגו שיטות לניטור רמות ROS תאיים במהלך ה-Ras-induced הזדקנות ביולוגית באינטרנט-38 fibroblasts אנושי נורמלי. רמות ROS תאיים תאים חיים ניתן למדוד באופן כמותי באמצעות הכימית תא חדיר DCF-DA ו flow cytometry. על ספיגת הסלולר, DCF-DA deacetylated על ידי esterases תאיים, לאחר מכן, תחמוצת על-ידי ROS להקים מאוד פלורסנט 2′, 7′-dichlorofluorescei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (2015R1D1A1A01060839) (קים יון יאנג) על ידי מענק הלאומי מחקר קרן של קוריאה (NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא 2016R1A2B2008887, לא 2016R1A5A2007009) (ליאן Jeanho).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
