Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Los linfocitos B son el jugador principal en la inmunidad humoral y el único tipo de célula en mamíferos que son capaces de producir anticuerpos, denominados también como inmunoglobulinas (Ig)^1,2. Anticuerpos secretados por las células de B proporcionan una defensa formidable contra los invasores patógenos a través de diversos mecanismos incluyendo la opsonización, neutralización y activación del complemento, conduciendo a inmunidad protectora³. Secreción de anticuerpos por las células B se logra después de la completa activación de células B específicas, que normalmente requiere que dos distintas señales³. Señal 1 es retransmitida por atascamiento directo del antígeno (Ag) al receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de ingenuo específico B células³. Dependiendo de la fuente de señal 2, activación de la célula de B puede dividirse en timo dependiente (TD) o timo-independientes (TI)^3,4. En una respuesta de antígeno TD, 2 señal es proporcionada por cognado T CD4 helper (T_H) las células activadas, que expresan CD154, el ligando para el receptor coestimuladoras CD40 expresado en las células de B^1,2,3. En una respuesta antígeno TI señal 2 viene de cualquier participación de receptores Toll-like (TLRs en el caso del tipo 1 TI Ag) o Cross-linking extenso de las BCRs (en el caso del tipo 2 TI Ag) en la B células^3,4. Antígenos de TI (TI-1) de tipo 1 son ligandos microbianos de TLRs, incluyendo lipopolisacáridos bacterianos (LPS), RNAs virales y CpG de ADN microbiano^4,5. Tipo 2 TI (TI-2) antígenos tienen estructura altamente repetitiva y son capaces de entregar prolongada y persistente de señalización a la célula de B por varios Cross-linking de la BCRs^4,6. Típicos los antígenos TI-2 ejemplos de polisacáridos de neumococos y polisacárido conjugado hapteno-^6,7. Antígenos de TD y TI pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con la ayuda brindada por el antígeno que presenta las células (APCs), como las células dendríticas (DCs)^{1 ,2,3}. Además, TD y TI antígenos son capaces de inducir respuestas de memoria con la ayuda de APC, pero TD antígenos son más eficientes en la inducción de memoria células B generación^3,8.

En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por la inmunización intraperitoneal (i.p.) con hemocianina de Lapa 2,4,6-trinitrophenyl-cerradura modelo hapteno conjugado antígenos (PNT-KLH) y PNT-polisacárido (neutro, muy ramificado y la Misa), respectivamente^9,10,11. Antígenos de TD se utilizan generalmente con un adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos¹². Aquí en nuestro protocolo, PNT-KLH se inyecta con el alumbre, un coadyuvante utilizado en estudios de inmunización¹². Otros ejemplos de aditivos que pueden utilizarse son completo o incompleto adyuvante de Freund (CFA o IFA), monophosphoryl-lípido A / dicorynomycolate de trehalosa (adyuvante de “Ribi del”) y oligodeoxynucleotides de CpG, etc.^{13, 14}. después de la inmunización, sueros de ratón son cosechados en diferentes puntos temporales y anticuerpos de PNT específicos en el suero se cuantifican utilizando Ig isotipo específica enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo^{9,10, 11}.

ELISA es un ensayo basado en la placa que es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en medicina y también como una herramienta de análisis en investigación biomédica^15,16. Se utiliza para detectar y cuantificar analitos como anticuerpos, hormonas, citoquinas, quimiocinas y varios antígenos, etcetera. ELISA se puede realizar en varios formatos diferentes, incluyendo directo, indirecto, sandwich y competitivo ELISA^15,16. En general, implica la inmovilización del antígeno en una superficie sólida, generalmente una placa de microtitulación de 96 pocillos, que se incuba con un anticuerpo primario. Después de la incubación, el anticuerpo no Unido se lava lejos. En un ELISA directo, el anticuerpo primario directamente se conjuga a una enzima (generalmente la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), que puede unirse un sustrato cromogénico para producir un cambio de color visible detectado por un instrumento de detección de señal como un Espectrofotómetro^15,16. Por el contrario, si un anticuerpo enzima-ligado del secundario se utiliza para enlazar el anticuerpo primario, entonces esto se considera como un indirecto ELISA^15,16. ELISA directo es más rápido mientras que ELISA indirecta es más sensible^15,16. En un sandwich ELISA, las placas están recubiertas con un anticuerpo de la «captura» utilizado para inmovilizar el antígeno de interés en las muestras, y luego puede detectarse el antígeno capturado por otro anticuerpo de la “detección” de una manera directa o indirecta^{15, 16}. ELISA Sandwich ofrece alta especificidad ya que el antígeno es detectado por dos diversos anticuerpos del antígeno. En un ELISA competitivo, la competencia se establece entre el antígeno de la muestra y el antígeno de limite de placa de unión del anticuerpo primario, y entonces la concentración de antígeno en la muestra se cuantifica midiendo la reducción de señal del substrato ^{15 , 16}. ELISA competitivo puede realizarse utilizando el formato mencionado directo o indirecto y es útil para la detección de antígenos pequeños con un único epitopo^15,16.

Técnicas alternativas para la medición de anticuerpos incluyen radio-inmunoanálisis (RIA), electrochemiluminescence (ECL) ensayo y superficie de resonancia de plasmon (SPR) ensayo¹⁷. RIA fue el primer inmunoensayo desarrollado que medidas la presencia de un antígeno (o anticuerpos) de alta especificidad y sensibilidad usando reactivos radiactivos^18,19. Sin embargo, debido a las preocupaciones de toxicidad radioactiva, sus costes de eliminación, vida útil y licencias especiales para trabajar con materiales radioactivos, ELISA es la mejor y más conveniente técnica común utiliza^20,21. ECL es un ensayo altamente sensible que reacciones de quimioluminiscencia se inician usando electricidad para generar especies altamente reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo y pueden ser utilizadas para medir la cantidad de analitos (como antígenos o anticuerpos)²². Sin embargo, ECL requiere un instrumento especial y por lo tanto no es tan ampliamente usado como ELISA²³. SPR es un ensayo directo que puede utilizarse para medir la Unión de ligandos (por ej., anticuerpos) para inmovilizar moléculas (e.g., antígenos) en un sensor chip superficial²⁴. SPR detecta las interacciones en tiempo real muy concreto y no requiere el uso de reactivos etiquetados como ELISA. Sin embargo, el SPR también requiere un equipo especial y tiene menor sensibilidad que el ELISA¹⁷. Dadas las limitaciones de los métodos alternativos, ELISA es la técnica más adecuada y conveniente para nuestro propósito en este protocolo. Aquí, describimos el uso de sandwich ELISA para el análisis de los niveles totales de isotipo de Ig y los procedimientos de ELISA indirecto para el análisis de los isotipos de Ig específica de antígeno.