Definierade Xeno-fri och Feeder-fri odlingsbetingelser för den Generation av mänskliga iPSC-derived Retinal cellmodeller
Summary
Produktionen av specialiserade retinala celler från pluripotenta stamceller är en vändpunkt i utvecklingen av stem cell-baserad terapi för retinala sjukdomar. Detta dokument beskriver en enkel metod för en effektiv generering av retinal organoids och retinal pigmenterade epitel för grundläggande, translationell och klinisk forskning.
Abstract
Produktionen av specialiserade celler från pluripotenta stamceller ger ett kraftfullt verktyg för att utveckla nya tillvägagångssätt för regenerativ medicin. Användningen av mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är särskilt attraktiva för neurodegenerativa sjukdomen studier, inklusive retinala dystrofier, där iPSC-derived retinal cellmodeller markerar ett stort steg framåt att förstå och bekämpa blindhet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och skalbar protokoll för att generera, mogen och frysa retinal organoids. Baserat på medellång förändras, den största fördelen med denna metod är att undvika flera och tidskrävande steg krävs allmänt en guidad differentiering av iPSCs. Detta protokoll härma tidiga faser av retinal utveckling av successiva förändringar av definierade media på vidhäftande mänskliga iPSC kulturer, och tillåter samtidig framställning av själv bildar neuroretinal strukturer och retinal pigmenterade (RPE) epitelceller i en reproducerbar och effektivt sätt i 4 veckor. Dessa strukturer som innehåller retinal stamceller (RPC-anrop) kan isoleras enkelt för vidare mognad i ett flytande kultur-villkor som möjliggör differentiering av RPC-anrop till de sju retinal celltyper som förekommer i vuxen mänskliga näthinnan. Dessutom beskriver vi snabba metoder för Frysförvaring av retinal organoids och RPE-celler för långsiktig lagring. Kombineras, kommer att metoderna som beskrivs här vara användbart att producera och bankens mänskliga iPSC-derived retinala celler eller vävnader för både grundforskning och klinisk forskning.
Introduction
Näthinnan är en integrerad del av det centrala nervsystemet (CNS) och har begränsad förmåga att regenerera spontant efter en traumatisk skada eller sjukdomar. Därför, degenerativa sjukdomar orsakar slutgiltiga retinal cellförlust, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaukom och diabetesretinopati, normalt leda till irreversibel blindhet. Undsättning degenererade näthinnan är en stor utmaning som stamceller-baserade terapier som syftar till att ersätta de skadade eller förlorade cellerna är en av de mest lovande metoder1,2,3. Pluripotenta stamceller som mänskliga embryonala stamceller (råden) celler eller mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har kapacitet att utökas på obestämd tid i kultur, och de har potential att producera alla celltyper. Framsteg i förståelsen av retinal utveckling och förbättring av in vitro- protokoll för mänskliga iPSC differentiering har resulterat i generationen av retinal organoids7,8,9, 10,11,12. Alla stora retinala celler, inklusive retinala ganglionceller (RGCs), fotoreceptorer och retinal pigmenterade epitelceller (RPE) har varit framgångsrikt åtskilt från mänskliga och sociala råden och iPSCs4,5, 6. utifrån metoden SFEB (serumfritt kultur av embryoid organ-liknande aggregat) som utvecklats av Eiraku et al. 13, själva bildandet av retinal organoids kan erhållas från ESC – eller iPSC-härledda embryoid organ-liknande aggregat i definierade extracellulär matrix komponenter7,10,14. Men dessa protokoll är invecklade, vilket kräver ett stort antal steg inte alltid kompatibel med stora produktionen av celler för behandlingsmetoder eller drogkontroll. Alltså, valet av metoden att producera mänskliga retinala celler är kritisk och metoden måste vara robust, skalbar och effektiv.
Här beskriver vi baserat på våra tidigare publikation15, varje steg för en enkel och effektiv generation av näthinnans celler genom retinal organoid själv bildas från vidhäftande mänskliga iPSCs odlas i en feeder-fri och xeno skick. Detta protokoll från rutinmässig kulturer av vidhäftande mänskliga iPSCs, och kräver bara en enkel successiva medium förändras så att generationen av både iPS-derived RPE (hiRPE)-celler och neuroretinal strukturer i 4 veckor. Efter en manuell isolering, hiRPE kan utvidgas och retinal strukturer kan vara odlade som flytande organoids där de retinala stamceller ska kunna differentieras till alla retinala celltyper i en ordningsföljd som är konsekvent med människan i vivo retinogenesis. Slutligen, för forskning befordran eller kliniska översättning beskriver vi en frysförvaring metod så att den långsiktiga lagringen av hela retinal organoids och hiRPE celler utan att påverka deras fenotypiska egenskaper och funktionalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver hur man producerar RPE-celler och retinal organoids, innehållande retinal RGCs och fotoreceptorer, från mänskliga pluripotenta stamceller i xeno-fri och feeder villkor. Kompatibel med god tillverkningssed (GMP) processen, metoden odlade presenteras här tillåter en stor produktion av iPSC-derived näthinnans celler som RPE celler, RGCs och fotoreceptorer för utveckling av stamceller-baserade terapier och läkemedel Discovery närmar sig för framtida behandling av retinala degenerativa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i Goureau’s team för deras insatser under installationen av de metoder som beskrivs här, och G. Gagliardi och M. Garita för deras kritisk läsning. Detta arbete stöds av bidrag från ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), föreningen Retina Frankrike och den tekniköverföring företaget SATT Lutech. Det framfördes också inom ramen för den LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) stöds av ANR inom programmet Investissements pris (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
