Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli
Summary
Burada retina pigment epiteli (RPE) hücreleri insan pluripotent kök hücre hasta kaynaklı mutasyonlar taşıyan ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Mutant hücre hatları immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe gibi fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu hastalık içinde yemek yaklaşım yerel insan RPE hücrelerinin alma zorluğu kaçınmanızı sağlar.
Abstract
Genetik mutasyonların 200’den fazla insan BEST1 gen tespit ve Retina dejeneratif hastalıklara bağlı olsa da, patolojik mekanizmaları özellikle BEST1 çalışmak için iyi vivo içinde manken eksikliği nedeniyle zor kalır ve onun mutasyonlar fizyolojik koşullar altında. BEST1 kodlar bir iyon kanalı, yani BESTROPHIN1 (BEST1), hangi işlevleri retina pigment epiteli (RPE); Ancak, yerel insan RPE hücrelerinin için son derece sınırlı erişilebilirlik bilimsel araştırmalar için büyük bir sorun temsil eder. Bu iletişim kuralı, insan RPEs insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) üzerinden indüklenen farklılaşma tarafından BEST1 hastalığa neden olan mutasyonlar taşıyan oluşturmak açıklar. HPSCs kendi kendine yenilenebilir olduğu gibi bu yaklaşım araştırmacılar hPSC-RPEs immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe, gibi çeşitli deneysel analizleri için sabit bir kaynağı olmasını sağlar ve böylece için çok güçlü bir çanak içinde hastalık modeli sağlar BEST1-Retina koşulları ilişkili. Özellikle, bu strateji RPE (patho) Fizyoloji ve diğer genler özgün olarak içinde RPE ifade ilgi çalışmaya uygulanır.
Introduction
En az beş Retina Dejeneratif hastalıkları BEST1 gen1,2,3,4,5,6 genetik mutasyonlar neden olduğu belgelenmiş oldu , 7 , 8, bildirilen mutasyonlar zaten üzerinde 200 ve hala artan sayıda. Bu BEST1-ilişkili hastalıklar, olarak da bilinen bestrophinopathies, neden ilerleyici görme kaybı ve hatta körlüğe ve şu anda hiçbir etkili tedaviler vardır. Protein ürünü olan BEST1, yani BESTROPHIN1 (BEST1), bu bir Ca2 +-özellikle retina pigment epiteli gözler5,6, içinde (RPE) ifade aktif Cl– kanal (CaCC) 8,9. Önemlisi, BEST1, bir klinik fenotip-ilişkili hastalıklar yanıttır azaltılmış görsel ışık tepe (LP) electrooculogram10,11‘; ölçülen denilen hafif uyaranlara LP RPE12,13,14CaCC tarafından aracılı inanılıyor. BEST1 mutasyonlar patolojik mekanizmaları daha iyi anlamak için ve potansiyel tedaviler doğru çalışması için mutant BEST1 kanalları endogenously ifade insan RPE hücrelerinde çalışma esastır.
RPE alma hücreleri doğrudan doğruya–dan canlı hastalar ise son derece pratik. Her ne kadar yerel RPE hücrelerinin insan kadavra ve fetusa biyopsi–dan hasat edilebilir, bu kaynakları için zor erişilebilirlik önemli ölçüde bilimsel araştırma sınırlar. Bu nedenle, insan gözü dışında alternatif RPE kaynaklar için önemlidir. Fonksiyonel RPE hücrelerinin şimdi insan pluripotent kök embriyonik kök hücreler (hESCs) de dahil olmak üzere hücre (hPSCs), Ayrıştırılan ve pluripotent kök hücreler (hiPSCs), ikinci indüklenen gibi bu çağrı kök hücre teknikleri, son gelişmeler tarafından yanıtlandı Birincil deri fibroblastlar bağış16,17,18yeniden programlama tarafından oluşturulan. Önemlisi, kendini yenileme ve pluripotency hPSCs, RPEs, hiPSCs hasta özgüllük ve hESCs (Örneğin, CRISPR tarafından) potansiyelini genomik değişiklik için çok yönlü bir çanak içinde hastalık modeli sunarken oluşturmak için güvenilir bir kaynak sağlamak İstenen BEST1 mutasyonlar.
hPSC-RPE fareler RPE modelleri birçok avantajı vardır: 1) BEST1 nakavt fareler fareler ve insanlar; arasında BEST1 RPE içinde farklı genetik gereksinimi olasılığını yükseltmek herhangi bir retina anormallik19, görüntü yok 2) yalnızca %3 insan RPE hücrelerinin binucleate, fareler%2035 aksine; 3) hiPSC-RPE potentiates klinik olarak otolog transplantasyon Retina tedavisinde bozuklukları21. Yine de hayvan modelleri hala canlı bir sistem içinde RPE fizyolojisi ve patoloji eğitimi için vazgeçilmezdir ve hiPSC oncogenic potansiyelini göz ardı edemem.
Araştırma ve klinik amaçlar için kullanılabilir RPE farklılaşma protokolü için kullanışlı ve orta derecede basit hPSC burada ile ilgili yordamı açıklamaktadır. HPSCs için daha fazla RPE ayırt etmek için tedavi aktivin-a. tarafından indüklenen olduğu sinir dokusu, farklılaşma çoğaltmak için nikotinamid (B3 vitamini) bu iletişim kuralını kullanır Nikotinamid tedavi pigmentli hücreleri (bir işareti farklılaşma RPE içine), sayısını artırmak için muhtemelen apoptotik hücreler22ayırt faaliyet inceltiyorum tarafından gösterilmiştir. Elde edilen hPSC-RPE hücreler aynı anahtar işaretleri, Arnavut kaldırımı Morfoloji ve hücresel işlevselliği yerel insan RPE hücrelerinin22görüntüler. Böylece, bir araştırma ortamda elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin immunoblotting, immunostaining ve bütün hücreli yama kelepçe, kendisi için de ayrıntılı deneysel yordamlar sağlanmaktadır gibi aşağı akım fonksiyonel analizleri için uygundur. Klinik olarak, kök hücrelerden türetilmiş RPE hücrelerinin glokom tedavisinde nakli için büyük bir potansiyel hayvan çalışmaları ve insan denemeler23göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
En önemli hastalık içinde yemek yaklaşım için hPSCs RPE BEST1için olduğunu doğru hücre lineage bir hastalığa neden olan mutasyona ile ayırt etmek için işlemdir. Böylece, her farklılaşma deneyden sonra elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin dikkatle olgun durumları için RPE özel türleri Morfoloji ve protein işaretleri16,17,18tarafından doğrulanması. Klonal artifakı en aza indirmek için birden çok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
