Summary
Burada retina pigment epiteli (RPE) hücreleri insan pluripotent kök hücre hasta kaynaklı mutasyonlar taşıyan ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Mutant hücre hatları immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe gibi fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu hastalık içinde yemek yaklaşım yerel insan RPE hücrelerinin alma zorluğu kaçınmanızı sağlar.
Abstract
Genetik mutasyonların 200'den fazla insan BEST1 gen tespit ve Retina dejeneratif hastalıklara bağlı olsa da, patolojik mekanizmaları özellikle BEST1 çalışmak için iyi vivo içinde manken eksikliği nedeniyle zor kalır ve onun mutasyonlar fizyolojik koşullar altında. BEST1 kodlar bir iyon kanalı, yani BESTROPHIN1 (BEST1), hangi işlevleri retina pigment epiteli (RPE); Ancak, yerel insan RPE hücrelerinin için son derece sınırlı erişilebilirlik bilimsel araştırmalar için büyük bir sorun temsil eder. Bu iletişim kuralı, insan RPEs insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) üzerinden indüklenen farklılaşma tarafından BEST1 hastalığa neden olan mutasyonlar taşıyan oluşturmak açıklar. HPSCs kendi kendine yenilenebilir olduğu gibi bu yaklaşım araştırmacılar hPSC-RPEs immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe, gibi çeşitli deneysel analizleri için sabit bir kaynağı olmasını sağlar ve böylece için çok güçlü bir çanak içinde hastalık modeli sağlar BEST1-Retina koşulları ilişkili. Özellikle, bu strateji RPE (patho) Fizyoloji ve diğer genler özgün olarak içinde RPE ifade ilgi çalışmaya uygulanır.
Introduction
En az beş Retina Dejeneratif hastalıkları BEST1 gen1,2,3,4,5,6 genetik mutasyonlar neden olduğu belgelenmiş oldu , 7 , 8, bildirilen mutasyonlar zaten üzerinde 200 ve hala artan sayıda. Bu BEST1-ilişkili hastalıklar, olarak da bilinen bestrophinopathies, neden ilerleyici görme kaybı ve hatta körlüğe ve şu anda hiçbir etkili tedaviler vardır. Protein ürünü olan BEST1, yani BESTROPHIN1 (BEST1), bu bir Ca2 +-özellikle retina pigment epiteli gözler5,6, içinde (RPE) ifade aktif Cl- kanal (CaCC) 8,9. Önemlisi, BEST1, bir klinik fenotip-ilişkili hastalıklar yanıttır azaltılmış görsel ışık tepe (LP) electrooculogram10,11'; ölçülen denilen hafif uyaranlara LP RPE12,13,14CaCC tarafından aracılı inanılıyor. BEST1 mutasyonlar patolojik mekanizmaları daha iyi anlamak için ve potansiyel tedaviler doğru çalışması için mutant BEST1 kanalları endogenously ifade insan RPE hücrelerinde çalışma esastır.
RPE alma hücreleri doğrudan doğruya--dan canlı hastalar ise son derece pratik. Her ne kadar yerel RPE hücrelerinin insan kadavra ve fetusa biyopsi--dan hasat edilebilir, bu kaynakları için zor erişilebilirlik önemli ölçüde bilimsel araştırma sınırlar. Bu nedenle, insan gözü dışında alternatif RPE kaynaklar için önemlidir. Fonksiyonel RPE hücrelerinin şimdi insan pluripotent kök embriyonik kök hücreler (hESCs) de dahil olmak üzere hücre (hPSCs), Ayrıştırılan ve pluripotent kök hücreler (hiPSCs), ikinci indüklenen gibi bu çağrı kök hücre teknikleri, son gelişmeler tarafından yanıtlandı Birincil deri fibroblastlar bağış16,17,18yeniden programlama tarafından oluşturulan. Önemlisi, kendini yenileme ve pluripotency hPSCs, RPEs, hiPSCs hasta özgüllük ve hESCs (Örneğin, CRISPR tarafından) potansiyelini genomik değişiklik için çok yönlü bir çanak içinde hastalık modeli sunarken oluşturmak için güvenilir bir kaynak sağlamak İstenen BEST1 mutasyonlar.
hPSC-RPE fareler RPE modelleri birçok avantajı vardır: 1) BEST1 nakavt fareler fareler ve insanlar; arasında BEST1 RPE içinde farklı genetik gereksinimi olasılığını yükseltmek herhangi bir retina anormallik19, görüntü yok 2) yalnızca %3 insan RPE hücrelerinin binucleate, fareler%2035 aksine; 3) hiPSC-RPE potentiates klinik olarak otolog transplantasyon Retina tedavisinde bozuklukları21. Yine de hayvan modelleri hala canlı bir sistem içinde RPE fizyolojisi ve patoloji eğitimi için vazgeçilmezdir ve hiPSC oncogenic potansiyelini göz ardı edemem.
Araştırma ve klinik amaçlar için kullanılabilir RPE farklılaşma protokolü için kullanışlı ve orta derecede basit hPSC burada ile ilgili yordamı açıklamaktadır. HPSCs için daha fazla RPE ayırt etmek için tedavi aktivin-a. tarafından indüklenen olduğu sinir dokusu, farklılaşma çoğaltmak için nikotinamid (B3 vitamini) bu iletişim kuralını kullanır Nikotinamid tedavi pigmentli hücreleri (bir işareti farklılaşma RPE içine), sayısını artırmak için muhtemelen apoptotik hücreler22ayırt faaliyet inceltiyorum tarafından gösterilmiştir. Elde edilen hPSC-RPE hücreler aynı anahtar işaretleri, Arnavut kaldırımı Morfoloji ve hücresel işlevselliği yerel insan RPE hücrelerinin22görüntüler. Böylece, bir araştırma ortamda elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin immunoblotting, immunostaining ve bütün hücreli yama kelepçe, kendisi için de ayrıntılı deneysel yordamlar sağlanmaktadır gibi aşağı akım fonksiyonel analizleri için uygundur. Klinik olarak, kök hücrelerden türetilmiş RPE hücrelerinin glokom tedavisinde nakli için büyük bir potansiyel hayvan çalışmaları ve insan denemeler23göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hPSC RPE için farklılaşma
- Korumak ve geçit hPSCs daha önce18açıklandığı gibi.
Not: tüm hücreleri (hPSCs ve hPSC-RPEs dahil olmak üzere) %5 CO2 büyüme ve farklılaşma protokolleri süresi boyunca 37 ° C'de yetiştirilen. -
Farklılaşma önce önceden kaplanmış 6-şey plakaları için konfluent hPSCs bölme.
- Tabak kat, membran matris yaklaşık 1 h için buz çözme, 1:50, 4 ° C DMEM orta liquidized matris askıya için seyreltme, her şey için 800 µL kaplama karışımı ekleyin ve en az 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya
- Kaplama tamamlandığında karışım Aspire edin ve hemen 1.5-2 mL orta kuyu ekleyin.
- HPSCs eski kültür plakalar üzerinden kaldırmak için PBS artı 0,5 mM EDTA, oda sıcaklığında 5 min için hücrelerle kuluçkaya, çözüm Aspire edin ve kültür orta ile küçük kümeleri hücrelerde resuspend.
- ~ % 20 confluency Yeni tabaklar içinde Tohum hücreleri.
Not:-20 ° C'de 100 µL aliquots membran matris depolamak ve bir 6-şey plaka kat için bir aliquot kullanın. Kaplama süre 4 h 37 ° C'de veya gecede oda sıcaklığında genişletilebilir. Askıya alma ve hPSCs 3-5 hücreler yerine tek hücreleri küçük kümeleri tohum önemlidir.
- Hücreler için tam confluency büyüdüğün zaman, farklılaşma Orta (4 mL/de) ile kültür orta yerine (Tablo 1, aktivin olmadan-A). Kültür 14 gün, Orta (4 mL/de) değiştirme 3 x / hafta.
Not: HPSC plaka yoğunluğu çiftler yaklaşık her 24 h önemli hücre ölümü farklılaşma yordamı başladıktan sonra bekleniyor. Toplamları ölü hücreleri ve enkaz Wells orta değişiklikler sırasında çıplak gözle görülebilir. - Gün 15 gün 28, farklılaşma orta 100 ng/mL insan aktivin-A (Tablo 1, insan aktivin-A) ile ek. Orta (4 mL/de) değiştirin 3 x / hafta.
- Gün 29 (Tablo 1, insan aktivin-A olmadan) başlangıç aktivin-A takviyesi durdurmak. Hücre farklılaşması ortamda 8 – 10 pigmente hPSC-RPE kümeleri (Şekil 1A-B) görününceye hafta kültür devam edin.
Not: Pigmentli hücreleri kümeleri olarak bir hücre kültür plaka üzerinde küçük karanlık noktalar (Şekil 1A-B, üst) çıplak gözle görülebilir. İmza Arnavut kaldırımı şeklinde bireysel pigmentli hücreleri 20 X mikroskop (Şekil 1A-B, alt) altında görülebilir.
2. izolasyon ve farklılaştırılmış RPE hücrelerinin kültür
- Farklılaşma orta kaldırmak, yıkama bir kez PBS ile % 0.05 tripsin artı 1 U/µL her kuyuya collagenase 1 mL ekleyin ve 20-30 dk. Kaldır tripsin/collagenase 37 ° C'de kuluçkaya ve yavaşça önceden ısıtılmış RPE orta 6-şey plaka her kuyuya 2 mL ekleyin (< C0 > tablo 2).
Not: ters bir mikroskop tripsin/collagenase tedavi öncesi poligonal, hPSC-RPE hücrelerinin morfolojisi izlemek için kullanın ve sonra yeterli sindirim yuvarlak haline. -
Pasteur pipetler çekme cam bir Bunsen burner kullanın.
- İki elle, uzun bir (9 inç) Pasteur pipet yatay bu yüzden her iki ucunda ve Bunsen burner yukarıda tutun yaklaşık 2/3 pipet ince parçası uzunluğu aşağı.
- Hızlı bir şekilde cam alev yumuşak olur sonra öyle ki mikro kazıyıcı gibi bahşiş pipet (Şekil 2) yeni sonunda oluşan iki ucu ayrı, çek.
- Birden çok hücre"Kazıma aletleri" oluşturmak için birkaç kere tekrar edin. Sterilizasyon için % 70 etanol ile çekti pipetler sprey ve onları hücre kültür mahallede kuruması.
-
Mikroskop altında bir mikro "hücre kazıyıcı" kullanmak yavaşça plaka kümelerden pigmente hPSC-RPE ayırmak için.
- Hafifçe dokunun (değil kazımak) doğrudan pigmentli hücreleri üzerinde hangi float kadar kültür orta bir kez onlar kuyunun dibinden ayırmak.
- Hemen 20 µL micropipette yavaşça Disosiye hPSC-RPE hücrelerinin emiş ve önceden kaplanmış bir 6-şey plakasına RPE orta24ile aktarmak için kullanın.
- Her iyi bir 12-şey tabak adımları 2.3.1–2.3.2 birden çok kez, gerektiğinde tekrar ederek ön kaplamalı ~ 5 x 103 hücre (20 X mikroskop altında gözlemlediği gibi ~ %10 confluency) toplamak. Orta son hacmi 2 mL getir.
Not: Disosiye hücreleri ortamda yüzen ama hala yerel olarak konsantre kalır bu Disosiye hPSC-RPE önlemek için yüzen gelen hücreler, hareket plakaların ayrılma işlemi sırasında kaçının.
- Kültür yeni izole hPSC RPE hücreleri (P0) 12-şey plakaları RPE ortamda başka bir 6-8 hafta pigmentli monolayer (Şekil 1 c) oluşturmak izin vermek için.
- Orta 3 değiştirmek x / hafta. Orta değiştirirken, eski orta yaklaşık 1/3 hacmi her kuyuya bırakın ve taze, önceden ısıtılmış RPE orta hacmi 2/3 ekleyin. Bu aşamada, her şey bir 12-şey plaka RPE Orta 2 mL kullanmak (böylece, orta 1.3 mL her zaman değişimi).
Not: P0 hPSC-RPE hücrelerinin monolayer kubbeler, hücrelerin aktif olarak sıvı taşınması ve sıkı kavşak25tarafından demirlemiş düşündüren oluşabilir. Bu nedenle, kubbenin oluşumu olgun RPE durumunun bir göstergesidir.
3. RPE kader doğrulama Immunoblotting tarafından
- HPSC-RPE hücre lysate memeli protein ayıklama tampon İndinavir inhibitörü ile birlikte kullanarak kokteyl yapmak. 30 dk aralıklarla 13.000 x g 4 ° C'de undissolved hücre artıkları atmak için 15 dk için de önce buz lysate cepten kuluçkaya. Toplam protein konsantrasyonu lysate ölçmek.
- 40 denatüre µg toplam protein Laemmli SDS örnek arabelleği 75 ° C'de 10 dk. ayırmak için protein örnekleri 15 dk ve sonra 150 V boya açık ulaşır kadar 90 V sabit voltaj, % 10 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerinde alt jel.
- Proteinler nitroselüloz membran 100 V 1 h için % 10 metanol ile takıma önceden soğutulmuş Tris-glisin arabellekte üzerine aktarın.
- Tris arabelleğe alınmış serum %0,1 non-iyonik deterjan (TBST) ve % 5 yağsız Kuru süt oda sıcaklığında 1 h için membran engelleyin.
- Membran gecede 4 ° C'de engelleme arabellekte seyreltilmiş birincil antikorlar ile kuluçkaya. RPE belirli işaret proteinler aşağıdaki gibi hedefleme antikorlar seyreltik: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. β-aktin, β-aktin yükleme denetimi olarak algılamaya 1:10,000 karşı antikor sulandırmak.
- Membran TBST 3 kez, 5 min her yıkama için ile ile yıkayın.
- Fareyle fluorophore konjuge keçi Anti-IgG seyreltilmiş ikincil antikor 1:10,000 oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabellekte membran kuluçkaya.
- Membran TBST 4 kez, 10 min her yıkama için ile ile yıkayın.
- Bir kızılötesi görüntüleme sistemi (Şekil 3) kullanarak proteinler algılamak.
4. BEST1 hücre altı yerelleştirme Immunostaining tarafından kontrol
- HPSC-RPE hücrelerinin PBS 2 mL ile bir kez yıkama ve % 4 paraformaldehyde 45 dakika oda sıcaklığında 2 mL fix.
- PBS 2 mL ile iki kez yıkama ve PBS 2 mL % 0,1 iyonik olmayan yüzey aktif ve % 2 eşek serum spesifik olmayan bağlayıcı siteleri engellemek 45 dk ile hücrelerde kuluçkaya.
- BEST1 antikor (1: 200 seyreltme) Oda sıcaklığında 2 h için hücrelerle kuluçkaya.
- PBS 3 kez 2 mL hücrelerle yıkayın. İle kuluçkaya fluorophore Birleşik oda sıcaklığında 1 h için ikincil IgG (1:1, 000).
- İlişkisiz ikincil antikor kaldırmak için PBS 3 kez 2 mL ile yıkayın.
- Lekeli hücreleri confocal mikroskobu (Şekil 4) gözlemlemek.
5. kayıt Ca2 +-hPSC-RPE tarafından bütün hücreli yama kelepçe bağımlı Cl- akım
- 24-72 saat önce yama kelepçe, bölünmüş bir tam konfluent de (12-şey plaka) üzerinde olgun P0 hPSC-RPE hücrelerinin (Arnavut kaldırımı şeklinde ve Pigmentli). Orta, yıkama bir kez PBS ile Aspire edin ve 1 mL % 0.05 tripsin artı 1 U/µL collagenase kuyunun içine ekleyin.
Not: önceden tripsin/collagenase kullanmadan önce 37 ° c sıcak. - 8 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Bu adımdan sonra hala yapışık ve bağlı hPSC-RPE hücrelerdir. - 1 mL micropipette hücreleri plaka dışına hafifçe yıkamak için kullanın ve sindirim karışımı hücrelerde 15 mL konik tüp aktarın. Önceden ısıtılmış tripsin/collagenase kalan hücreleri toplamak ve onları 15 mL konik tüp içine birleştirmek için 1 mL ile iyi yıkayın.
Not: HPSC-RPE hücrelerinin bu noktada hala büyük kümeleri vardır. Dinç pipetting tarafından hücre kümeleri kırmaya çalışmayın. Bazı kümeleri 1 mL ucu iç duvara yapışabilir. - 8 dk. 37 ° C kuru banyo konik tüp kuluçkaya.
- 1 mL micropipette hafifçe alçalarak pipet için 10-15 kat sindirim karışımı kullanın.
Not: Hücre kümeleri çok daha küçük ama hala görünür hale gelir. Dinç pipetting kaçının. - Önceki iki adımı yineleyin.
Not: Çoğu hücreleri tek hücre süspansiyon pipetting sonra olmalıdır. Kabul edilebilir bazı küçük hücre kümeleri olabilir. İsteğe bağlı: bir ek 5 min nazik pipetting tarafından takip için 37 ° C'de konik tüp kuluçkaya. Tripsin/collagenase 37 ° C'de toplam zaman 30 dk (8 + 8 + 8 + 5 = 29) aşmaması gerekir. - Önceden ısıtılmış RPE orta 5 mL sindirilir hücreleri içeren 15 mL konik tüp ekleyin. 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de spin. Ön kaplamalı 35 mm yemekleri, 10-%20 confluency yeniden askıya alma ve tohum hücreleri (Örneğin, % 100 de % 10 confluency için beş 35 mm yemekleri için 12-şey tabakta konfluent).
Not: her zaman, güçlü pipetting, kaçının hangi aralıklarla sonra belirgin karanlık hücre artıkları süpernatant içinde gösterdiği gibi önemli hücre ölümüne neden olabilir. İyi ayrılmış tek hücreli tohum yama kelepçe kayıt için gereklidir. - Bütün hücre yama gerçekleştirmek18,26,27,28,29,30,31daha önce açıklandığı gibi kelepçe. Aileden adım potansiyelleri olan geçerli izleri elde (-100 + 100 için mV holding potansiyel 0 dan mV) (Şekil 5).
Not: İç ve dış çözümleri tarifleri Tablo 3 ve Tablo 4, sırasıyla açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklılaştırılmış P0 hPSC-RPE popülasyondan alınmış bir yüksek saflıkta elde amaçlamaktadır el ile yalıtım teknik açıdan en zor adımdır. Sonra başarılı bir yalıtım > P0 popülasyonda % 90 hücreleri büyüyecek ve imza RPE türleri morfoloji (Şekil 1 c) görüntülemek için olgun. RPE sigara veya P0 nüfus olgunlaşmamış RPE hücrelerinde küçük bir bölümünü varlığını neredeyse kaçınılmaz ama ezici pigmente ve Arnavut kaldırımı şeklinde hPSC RPE hücrelerinin sayısı olduğu sürece aşağı akım deneylerden engel olmaz çoğunluk.
HPSC-RPE dayalı çanak içinde hastalık yaklaşımı ile her hastaya özgü BEST1 mutasyon protein ifadesini (immunoblotting, Şekil 3), membran ticareti () için kapsamlı bir şekilde karakterize vivo içinde olabilir immunostaining, Şekil 4) ve iyon kanal fonksiyonu (bütün hücreli yama kelepçe, Şekil 5). Bu sonuçlar kanal mutasyonların patolojik mekanizmalar elucidating ve Kişiselleştirilmiş tıp geliştirme kritik bilgileri sağlayacaktır.
BEST1 ağırlıklı olarak RPE hücrelerinde ifade edildiği gibi olgun bir RPE durumu doğrulama hücresel avans olarak kullanılabilir. Bu RPE65 ve CRALBP hala gerek gibi diğer köklü RPE işaretleri (Şekil 3) değerlendirilen bu yüzden bazı BEST1 mutasyonlar protein ifadesini etkileyebilecek olması gerekmektedir.
Olgunlaştı P0 hPSC-RPE hücrelerinin 2-3 ay önce (P-1) bütün hücreli yama kelepçe için bölme için muhafaza edilebilir. P0 hücreleri 3 aydan daha büyük yama kelepçe için tavsiye edilmez ama hala immunoblotting ve immunostaining deneyler için kullanılabilir.
Şekil 1: hPSC-RPE hücrelerinin farklı aşamalarında Ayrıştırılan. Temsili resim kültür plaka ilk görünüm(a)yalıtım (B) öncesi ve sonrası büyüme vade pigmente hPSC-RPE kümelerinin yalıtım (C) gönderebilir. Görünüm ve 20 X faz kontrast resim üst ve alt panellerinde sırasıyla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mikro hücre kazıyıcı temsilcisi görüntüsünü Pasteur pipet çekti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: farklılaşmış hPSC-RPE olgun RPE durumunu doğrulama hücreleri tarafından immunoblotting. RPE özel protein işaretleri BEST1, RPE65 ve CRALBP ifade WT hPSC ve hPSC-RPE hücrelerinde gösterilen lekesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: WT hPSC-RPEs BEST1 Immunostaining. WT BEST1 membran lokalizasyonu Arnavut kaldırımı şeklinde hPSC-RPE hücrelerinde gösterilen(a)temsilcisi immünfloresan görüntüler. (B) Immunostaining BEST1 birincil antikor atlama denetim negatif.
Şekil 5: bütün hücreli yama kelepçe kayıtları hPSC-RPEs. (A) A tek hPSC-RPE hücre bütün hücreli yama kelepçe için. (B) temsilcisi geçerli izleri bir BEST1 WT hPSC-RPE ve bir BEST1 hPSC-RPE en yüksek Ca2 +mutasyona uğramış. Akımları temin için kullanılan voltaj iletişim kuralı INSERT gösterilir. Ölçek çubuğu 1 nA, = 150 Bayan bkz: Tablo 3 ve Tablo 4 yama için kelepçe hazırlık ayrıntılar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | Tutar |
| Knock-Out (KO) DMEM | 500 mL |
| KO serumu değiştirme | (75 mL) % 15 |
| Gerekli olmayan amino asitler | %1 (5 mL) |
| Glutamin | %1 (5 mL) |
| Penisilin-streptomisin | %1 (5 mL) |
| Nikotinamid | 10 mM |
| İnsan aktivin-A * | 100 ng/mL |
| * İnsan aktivin-A farklılaşma protokolünün gün boyunca 15-28 desteklenen. | |
Tablo 1: RPE farklılaşma orta.
| Reaktif | Tutar |
| MEM (α Modifikasyon) | 500 mL |
| Fetal sığır Serum | %5 (25 mL) |
| N1 ek | %1 (5 mL) |
| Glutamin-penisilin-streptomisin | %1 (5 mL) |
| Gerekli olmayan amino asitler | %1 (5 mL) |
| Taurin | 125 mg |
| Hidrokortizon | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
Tablo 2: RPE kültür orta.
| Reaktif | Konsantrasyon |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnezyum ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| CaCl2* | Değişir |
| Glikoz ** | ~ 5 mM |
| * Eklemek istediğiniz Ca2 + konsantrasyonu elde etmek için CaCl2 | |
| ** Glikoz Osmolarite 290-295 mOsm/L için ayarlamak için kullanın | |
Tablo 3: Yama kelepçe iç çözüm.
| Reaktif | Konsantrasyon |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| Glikoz * | ~ 5 mM |
| * Glikoz Osmolarite 300-305 mOsm/l için ayarlamak için kullanın | |
Tablo 4: Yama kelepçe Harici çözüm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En önemli hastalık içinde yemek yaklaşım için hPSCs RPE BEST1için olduğunu doğru hücre lineage bir hastalığa neden olan mutasyona ile ayırt etmek için işlemdir. Böylece, her farklılaşma deneyden sonra elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin dikkatle olgun durumları için RPE özel türleri Morfoloji ve protein işaretleri16,17,18tarafından doğrulanması. Klonal artifakı en aza indirmek için birden çok hiPSC klonlar aynı hastadan veya birden çok hESC klonlar aynı mutasyon ile mümkün olduğunda kullanılmalıdır.
HiPSC ve hESC çizgiler RPE için aynı protokolü ile farklı. hiPSCs veya BEST1 gene bir mutasyon olmadan BEST1 hasta veya sağlıklı bağış, cilt fibroblastlar sırasıyla programlanabilir. hESCs BEST1 içinde bir mutasyon taşıyan vahşi-tipi (WT) BEST1 ebeveyn hESC satırından genetik. HiPSC-RPE ve hESC-RPE yolları kendi avantaj ve dezavantajları vardır. Eski daha hasta özel ve klinik olarak ilgili, özellikle Kişiselleştirilmiş tıp. Ancak, bu hiPSC-RPE yaklaşım bazı sınırlamaları vardır dikkati çekiyor: 1) Lojistik olarak bağış hastalardan cant her zaman verilebilir, ve bazı mutasyonlar çok BEST1 hasta numuneleri, tam bir spektrum erişim zordur ilk etapta nadir; 2) non-spesifik fenotipleri farklı genetik geçmişleri ve bağış fiziksel koşulları neden olabilir; 3) öyle ki bazı durumlarda teknik olarak hiPSC-RPEs elde etmek için zor olabilir hiPSC RPE farklılaşma verimliliği için farklı bağış için değişir. Öte yandan, hESC-RPE güzergahı, ancak daha fazla yapay, isogenic hESC-RPEs olmayan önyargılı işlevsel araştırmalar için talebe istenen mutasyonlar ile üretmek için çok yönlü bir platform sunmaktadır.
Olgun RPE hücrelerinin pigmentli, poligonal ve sıkı kavşak içinde bir monolayer tarafından bağlı. Bir tek hücre nüfus için yama kelepçe içine bölme sonra taze reseeded hPSC-RPE hücrelerinin Çokgen şeklin kaybetmek, ama hala pigmentasyon birkaç gün (Şekil 5A) tutmak. Yama kelepçe gerçekleştirilen 24-72 h zaman zarfında pigmentasyon hala görünür bir işareti olarak iyi RPE durumu olan hücreleri seçmek için kullanılabilir hücre bölme sonra olduğunu. Yama kelepçe başarının anahtarı, önemli hücre ölümü olmayan iyi ayrılmış tek hücreler çoğunluğu sonuçlanan bölünmüş bir nazik hücredir.
Farklı hücre kültür medya ve büyüme faktörleri kullanarak birkaç farklılaşma protokol edebiyat21,32belgeledi. Farklılaşma hPSC RPE için gereken süre o yan yana karşılaştırma olmadan farklılaşma verimliliği önemli herhangi bir fark olup olmadığını söylemek zor olmakla birlikte bizim de dahil olmak üzere bu iletişim kuralları içinde benzer. Geçerli protokol hPSC-RPE hücrelerinin normal düz dipli levha yetişir ama bu yordam tarafından oluşturulan hPSC RPE değil en iyi özetlemek bu yüzden membran ekler ile plakalar üzerinde RPE polarite vivo içindehücreleri değil unutulmamalıdır. Bu nedenle, oluşturulan hPSC-RPE hücrelerinin de Transwell plakaları formu monolayer RPE sayfalarına klinik amaçlar için17, kültürlü, ancak yukarıda açıklanan teknikleri çoğunlukla bir araştırma ayarı33, uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
