Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1
Summary
Aquí presentamos un protocolo para diferenciar células del pigmento retiniano epitelio (RPE) de las células de vástago pluripotent humana teniendo mutaciones derivados del paciente. Las líneas celulares mutantes pueden utilizarse para el análisis funcionales como immunoblotting, inmunofluorescencia, abrazadera del remiendo. Este enfoque de la enfermedad en plato evita la dificultad de obtención de células de EPR humanas nativas.
Abstract
Aunque más de 200 mutaciones genéticas en el gene humano de BEST1 han identificado y ligado a enfermedades degenerativas de la retina, los mecanismos patológicos siendo esquivos debido principalmente a la falta de un modelo de buen en vivo para el estudio de BEST1 y sus mutaciones en condiciones fisiológicas. BEST1 codifica un canal iónico, es decir, BESTROPHIN1 (BEST1), que funciona en epitelio retiniano del pigmento (RPE); sin embargo, la accesibilidad muy limitada a las células RPE humanas nativas representa un reto para la investigación científica. Este protocolo describe cómo generar humanos RPEs BEST1 mutaciones enfermedad-que causan del cojinete por la diferenciación inducida de células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Como hPSCs es auto renovables, este enfoque permite a los investigadores a tener una fuente constante de hPSC-RPEs para distintos análisis experimentales, como el immunoblotting, inmunofluorescencia y abrazadera del remiendo y así proporciona un modelo de enfermedad en un plato muy de gran alcance para BEST1-condiciones retinales asociadas. En particular, esta estrategia puede aplicarse para estudiar la fisiología de la RPE (patho) y otros genes de interés nativamente en RPE.
Introduction
Se ha documentado que al menos cinco enfermedades degenerativas retinianas son causadas por mutaciones genéticas en el BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, con el número de mutaciones divulgadas ya sobre 200 y aún creciente. Estos BEST1-enfermedades asociadas, también conocido como bestrophinopathies, causan la pérdida progresiva de la visión e incluso ceguera, y actualmente no existen efectivos tratamientos. El producto de la proteína de BEST1, a saber, BESTROPHIN1 (BEST1), es un Ca2 +-activado canal de Cl– (CaCC) específicamente expresado en el epitelio retiniano del pigmento (RPE) de los ojos5,6, 8,9. Lo importante es un fenotipo clínico de BEST1-enfermedades asociadas es la disminución en la respuesta visual a los estímulos de luz, llamado light peak (LP) medido en el electrooculograma10,11; LP se cree para ser mediado por un CaCC en RPE12,13,14. Para comprender mejor los mecanismos patológicos de las mutaciones BEST1 y procurar terapias potenciales, resulta esencial para estudiar los canales del mutante BEST1 endógeno expresados en células humanas de la RPE.
Sin embargo, obteniendo RPE células directamente de pacientes vivo es altamente impráctico. Aunque nativas células RPE pueden ser cosechadas de las biopsias de cadáveres humanos y de fetos, la difícil accesibilidad a estas fuentes limita significativamente la investigación científica. Por lo tanto, es crítico contar con fuentes alternativas de RPE que no sean los ojos humanos. Esta llamada ha sido contestada por los avances recientes en técnicas de células madre, células RPE funcionales ahora pueden ser distinguidas de células de vástago de pluripotent humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) e inducida de pluripotent células (hiPSCs), este último ser generadas por la reprogramación de fibroblastos de piel primaria de donantes16,17,18. Lo importante es la auto renovación y pluripotencia de hPSCs aseguran una fuente confiable para generar RPEs, mientras que la especificidad de paciente de hiPSCs y potencial modificación genómica de hESCs (p. ej., por CRISPR) ofrecen un modelo de enfermedad en plato versátil para mutaciones de BEST1 deseadas.
hPSC-RPE tiene varias ventajas sobre los ratones modelos RPE: 1) ratones knockout de BEST1 no muestran ninguna anormalidad retiniana19, levantando la posibilidad de diverso requisito genético de BEST1 en RPE entre ratones y humanos; 2) sólo el 3% de células humanas de RPE son binucleado, en contraste con 35% en ratones20; 3) hiPSC-RPE potencializa el trasplante autólogo en clínica tratamiento de retina trastornos21. Sin embargo, los modelos animales están siendo indispensables para el estudio de patología y fisiología RPE en un sistema vivo y no puede ser pasado por alto el potencial oncogénico de hiPSC.
El procedimiento aquí describe un hPSC moderado simple y útil en el protocolo de diferenciación de RPE que puede utilizarse para fines de investigación y clínicos. Este protocolo utiliza nicotinamida (vitamina B3) para aumentar la diferenciación de hPSCs al tejido neural, que además se induce a diferenciarse en RPE por tratamiento con activina-A. Tratamiento de nicotinamida ha demostrado aumentar el número de células pigmentadas (un signo de diferenciación en RPE), posiblemente por atenuar la actividad apoptótica de diferenciar células22. Las células de RPE hPSC resultante muestran los mismos marcadores claves, guijarro morfología y funcionalidad celular como nativo humano RPE células22. Así, en un entorno de investigación, las células de RPE hPSC resultantes son adecuadas para posteriores análisis funcionales incluyendo immunoblotting, inmunotinción y abrazadera del remiendo de celulares, para que también se proporcionan procedimientos experimentales detallados. Clínicamente, las células RPE derivadas de células madre han demostrado gran potencial para el tratamiento de trasplante de la degeneración macular en estudios en animales y ensayos humanos23.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento más importante para el abordaje de la enfermedad en plato es distinguir hPSCs con una mutación enfermedad-que causan que el linaje de la célula correcta, que es el RPE para BEST1. Así, después de cada experimento de diferenciación, las células RPE hPSC resultante deben ser cuidadosamente validadas para su estado maduro morfologías específicas de RPE y proteínas marcadores16,17,18. Para minimiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
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