Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1
Summary
Qui presentiamo un protocollo per differenziare cellule del pigmento retinico epitelio (RPE) da cellule staminali pluripotenti umane recanti mutazioni paziente-derivate. Le linee cellulari mutanti possono essere utilizzate per analisi funzionali tra cui immunoblotting, immunofluorescenza e patch clamp. Questo approccio di malattia-in-un-piatto aggira la difficoltà di ottenere cellule RPE umane native.
Abstract
Anche se oltre 200 mutazioni genetiche nel gene BEST1 umano sono state identificate e collegate a malattie degenerative retiniche, i meccanismi patologici rimangono evasivi principalmente a causa della mancanza di un modello di buona in vivo per lo Studio BEST1 e sue mutazioni in condizioni fisiologiche. BEST1 codifica una scanalatura dello ione, vale a dire BESTROPHIN1 (BEST1), che funziona in epitelio retinico del pigmento (RPE); Tuttavia, l’accessibilità estremamente limitata alle cellule RPE umane native rappresenta una sfida importante per la ricerca scientifica. Questo protocollo viene descritto come generare umano RPEs recanti mutazioni malattia-causanti BEST1 di differenziazione indotta da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Come hPSCs sono auto-rinnovabili, questo approccio permette ai ricercatori di avere una costante fonte di hPSC-RPEs per varie analisi sperimentali, quali immunoblotting, immunofluorescenza e patch clamp e quindi fornisce un modello di malattia-in-un-piatto molto potente per BEST1-associate condizioni della retina. In particolare, questa strategia può essere applicata per studiare la fisiologia RPE (patho) e altri geni di interesse espresso in modo nativo in RPE.
Introduction
È stato documentato che almeno cinque malattie degenerative retiniche sono causate da mutazioni genetiche in BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, con il numero di mutazioni segnalate già oltre 200 e ancora crescente. Questi BEST1-malattie associate, noto anche come bestrophinopathies, causano perdita progressiva della vista e persino cecità, e attualmente esistono cure efficaci. Il prodotto proteico del BEST1, vale a dire BESTROPHIN1 (BEST1), è un Ca2 +-canale attivato Cl– (CaCC) specificamente espresso nell’epitelio retinico del pigmento (RPE) dei occhi5,6, 8,9. D’importanza, un fenotipo clinico di BEST1-malattie associate è la risposta visiva ridotta a stimoli luminosi, chiamato light peak (LP) misurata nel electrooculogram10,11; LP è creduta per essere mediato da un CaCC in RPE12,13,14. Al fine di meglio comprendere i meccanismi patologici di mutazioni BEST1 e ad adoperarsi per potenziali terapie, è essenziale per lo studio di canali BEST1 mutati in modo endogeno espresse in cellule umane di RPE.
Tuttavia, ottenere RPE cellule direttamente dai pazienti dal vivo è altamente impraticabile. Anche se cellule RPE native possono essere raccolto dalle biopsie di cadaveri umani e feti, la difficile accessibilità a tali fonti limita notevolmente la ricerca scientifica. Pertanto, è fondamentale disporre di fonti alternative di RPE diverso da occhi umani. Questa chiamata è stata accettata dai recenti progressi nelle tecniche di cellule staminali, come cellule RPE funzionali possono ora essere differenziate da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), tra cui le cellule staminali embrionali (hESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (hiPSCs), quest’ultimo Essendo generato riprogrammando fibroblasti primari della pelle da donatori16,17,18. D’importanza, l’auto-rinnovamento e pluripotenza di hPSCs garantiscono una fonte affidabile per generare RPEs, mentre la paziente-specificità di hiPSCs e potenziale genomico modificazione delle hESCs (ad es., da CRISPR) offrono un modello di malattia-in-un-piatto versatile per mutazioni BEST1 desiderate.
hPSC-RPE ha diversi vantaggi rispetto ai topi modelli RPE: 1) topi knockout BEST1 non visualizzare qualsiasi anomalia retinica19, sollevando la possibilità di diverse esigenze genetiche degli BEST1 in RPE tra topi e nell’uomo; 2) solo il 3% di cellule RPE sono binucleate, in contrasto con il 35% in topi20; 3) hiPSC-RPE rafforza il trapianto autologo in clinica trattamento della retina disturbi21. Tuttavia, modelli animali sono ancora indispensabili per lo studio di RPE fisiologia e patologia in un sistema live, e non può essere trascurato il potenziale oncogeno dei hiPSC.
La procedura qui descrive un hPSC utile e moderatamente semplice protocollo di differenziazione di RPE che può essere utilizzato per scopi clinici e di ricerca. Questo protocollo utilizza la nicotinammide (vitamina B3) per aumentare la differenziazione di hPSCs tessuto neurale, che è ulteriormente indotte a differenziarsi in RPE dal trattamento con activina-A. Trattamento di nicotinammide è stato indicato per aumentare il numero delle cellule pigmentate (un segno di differenziazione in RPE), possibilmente attenuando l’attività apoptotica di differenziare cellule22. Le celle di hPSC-RPE risultante visualizzato la stessi chiavi marcatori, ciottoli morfologia e funzionalità cellulare come nativo di cellule RPE22umana. Così, in un ambiente di ricerca, le cellule RPE hPSC risultante sono adatte per le analisi funzionali a valle compreso immunoblotting, immunostaining e cellule intere patch clamp, per cui dettagliate procedure sperimentali sono inoltre fornite. Clinicamente, le cellule RPE derivate da cellule staminali hanno dimostrato grande potenziale per il trattamento di trapianto di degenerazione maculare in entrambi gli studi sugli animali e le prove umane23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura più importante per l’approccio di malattia nel piatto è di differenziare hPSCs con una mutazione patogenetica del lineage di cella corretta, ovvero RPE per BEST1. Così, dopo ogni esperimento di differenziazione, le cellule RPE hPSC risultante devono essere convalidate con attenzione per il loro stato maturo di morfologie RPE-specifici e proteina marker16,17,18. Per ridurre al minimo artefatto clonale, cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH EY025290, GM127652 e Università di Rochester finanziamento di Start-up.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
