Summary
Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.
Abstract
Hoewel meer dan 200 genetische mutaties in het menselijk BEST1 -gen zijn geïdentificeerd en gekoppeld aan retinale degeneratieve ziekten, blijven de pathologische mechanismen ongrijpbare voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een goede in-vivo -model voor het bestuderen van BEST1 en zijn mutaties onder fysiologische omstandigheden. BEST1 codeert een ionkanaal, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), die werkt in de retinale pigment epitheel (RPE); echter vormt de uiterst beperkte toegankelijkheid aan inheemse menselijke RPE cellen een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van menselijke RPEs, rekening houdend met BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties door geïnduceerde differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Als hPSCs zelf hernieuwbare zijn, deze aanpak kan onderzoekers hebben een constante bron van hPSC-RPEs voor verschillende experimentele analyses, zoals immunoblotting, immunofluorescentie, en patch-klem, en biedt dus een zeer krachtige model van het ziekte-in-a-schotel voor BEST1-netvlies voorwaarden verbonden. Met name kan deze strategie worden toegepast om te studeren RPE (patho) fysiologie en andere genen van belang native uitgedrukt in RPE.
Introduction
Het is gedocumenteerd die ten minste vijf retinale degeneratieve ziekten worden veroorzaakt door genetische mutaties in het BEST1 gen1,2,3,,4,5,6 , 7 , 8, met het aantal gerapporteerde mutaties al meer dan 200 en nog steeds groeiende. Deze BEST1-geassocieerde ziekten, ook bekend als bestrophinopathies, progressieve visie verlies en zelfs blindheid veroorzaken en er zijn momenteel geen doeltreffende behandelingen. Het eiwit product van BEST1, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), is een Ca2 +-geactiveerde Cl- -kanaal (CaCC) speciaal onder het retinale pigment epitheel (RPE) van de ogen5,6, uitgedruktin 8,9. Nog belangrijker is, een klinische fenotype van BEST1-geassocieerde ziekten is de verminderde visuele reactie op lichte stimuli, genaamd lichte piek (LP) gemeten in de electrooculogram10,11; LP wordt verondersteld te worden bemiddeld door een CaCC in RPE12,13,14. Om de pathologische mechanismen van BEST1 mutaties beter te begrijpen en te streven naar mogelijke therapieën, is het essentieel om te studeren van mutant BEST1 kanalen endogeen uitgedrukt in menselijke RPE cellen.
Verkrijgen van RPE cellen rechtstreeks uit levende patiënten echter zeer onpraktisch. Hoewel inheemse RPE cellen kunnen worden geoogst vanaf Biopten van menselijke kadavers en foetussen, beperkt de moeilijke toegang tot deze bronnen aanzienlijk wetenschappelijk onderzoek. Daarom is het essentieel dat alternatieve RPE bronnen dan menselijke ogen. Deze oproep is beantwoord door de recente vooruitgang in de cel van de stam technieken, zoals functionele RPE cellen nu van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), met inbegrip van embryonale stamcellen (hESCs) kunnen worden onderscheiden en pluripotente stamcellen (hiPSCs), de laatste geïnduceerde wordt gegenereerd door de herprogrammering van de primaire huid fibroblasten van donoren16,17,18. Nog belangrijker is, zorgen de zelf-vernieuwing en pluripotent van hPSCs voor een betrouwbare bron voor het genereren van RPEs, terwijl de patiënt-specificiteit van hiPSCs en het potentieel van de genomic wijziging van hESCs (bijvoorbeelddoor CRISPR) bieden een veelzijdige ziekte-in-a-schotel-model voor gewenste BEST1 mutaties.
hPSC-RPE heeft diverse voordelen ten opzichte van muizen RPE modellen: 1) BEST1 knock-out muizen worden niet weergegeven voor elk netvlies abnormaliteit19, verhogen van de mogelijkheid van verschillende genetische vereiste van BEST1 in RPE tussen muizen en mensen; 2) slechts 3% van menselijke RPE cellen zijn binucleate, in tegenstelling tot 35% in muizen20; 3) hiPSC-RPE potentiates autologe transplantatie in de klinische behandeling van retinale stoornissen21. Niettemin, dierlijke modellen zijn nog steeds onmisbaar voor het bestuderen van RPE fysiologie en pathologie in een live systeem en het oncogene potentieel van hiPSC mag niet worden genegeerd.
De procedure hier beschrijft een nuttig en matig eenvoudige hPSC RPE differentiatie protocol die kunnen worden gebruikt voor onderzoek en klinische doeleinden. Dit protocol gebruikt nicotinamide (vitamine B3) om te vergroten van differentiatie van hPSCs naar zenuwweefsel, die verder wordt veroorzaakt om te differentiëren in RPE door behandeling met activin-A. Nicotinamide behandeling is aangetoond dat het verhogen van het aantal gepigmenteerde cellen (een teken van differentiatie in RPE), eventueel door de activiteit van de apoptotic cellen22differentiëren verzachtende. De resulterende hPSC-RPE cellen weergeven de dezelfde belangrijke markeringen, geplaveide morfologie en cellulaire functionaliteit als inheemse menselijke RPE cellen22. Dus, in de instelling van een onderzoek, de resulterende hPSC-RPE cellen zijn geschikt voor downstream functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunokleuring en geheel-cel patch-klem, waarvoor gedetailleerde experimentele procedures zijn ook beschikbaar. RPE cellen afgeleid van stamcellen hebben klinisch, zowel dierlijke studies en menselijke proeven23zien groot potentieel voor transplantatie behandeling van macula degeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentiatie van hPSC aan RPE
- Onderhouden en passage hPSCs18zoals hiervoor is beschreven.
Opmerking: Alle cellen (met inbegrip van hPSCs en hPSC-RPEs) worden gekweekt in 37 ° C bij 5% CO2 gedurende de looptijd van de groei en differentiatie protocollen. -
Voorafgaand aan de differentiatie, splitsen confluente hPSCs aan vooraf gecoate 6-Wells-platen.
- Jas van platen, kelder membraan matrix op ijs gedurende ongeveer 1 uur ontdooien, schorten liquidized matrix in 4 ° C DMEM medium op een 1:50 verdunning, 800 µL coating mengsel toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C.
- Wanneer coating voltooid is, gecombineerd het mengsel en voeg onmiddellijk 1,5 – 2 mL medium in de putjes.
- Te heffen hPSCs aan de oude cultuur platen, cellen met PBS plus 0,5 mM EDTA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen de oplossing gecombineerd en resuspendeer de cellen in kleine bosjes met kweekmedium.
- Zaad-cellen op ~ 20% confluentie in de nieuwe platen.
Opmerking: Kelder membraan matrix opgeslagen in 100 µL aliquots bij-20 ° C en gebruik één aliquot jas van een 6-well-plate. De tijd voor coating kan worden uitgebreid tot 4 uur bij 37 ° C, of 's nachts bij kamertemperatuur. Het is belangrijk op te schorten en zaad van hPSCs als kleine bosjes van 3 – 5 cellen in plaats van afzonderlijke cellen.
- Wanneer de cellen worden gekweekt aan volledige confluentie, vervang het kweekmedium met differentiatie medium (4 mL/putje) (tabel 1, zonder activin-A). Cultuur voor 14 dagen, het veranderen van het medium (4 mL/putje) 3 x / week.
Opmerking: De hPSC plaat dichtheid verdubbelt ongeveer elke 24 h. aanzienlijke celdood wordt verwacht na het begin van de procedure van de differentiatie. Aggregaten van de dode cellen en puin in de putjes kunnen worden gezien met het blote oog tijdens middellange wijzigingen. - Van dag 15 tot dag 28, door differentiatie medium te vullen met 100 ng/mL mens activin-A (tabel 1, met mens activin-A). Wijzigen van het medium (4 mL/putje) 3 x / week.
- Stop activin-A suppletie beginnen op dag 29 (tabel 1, zonder menselijk activin-A). Blijven cel kweken in differentiatie medium voor 8-10 weken totdat gepigmenteerde hPSC-RPE clusters (figuur 1A-B) verschijnen.
Opmerking: Clusters van gepigmenteerde cellen kunnen worden gezien als kleine donkere puntjes op een cel cultuur plaat met het blote oog (figuur 1A-B, bovenaan). Afzonderlijke gepigmenteerde cellen met de handtekening geplaveide vorm kunnen worden gezien onder een 20 X Microscoop (figuur 1A-B, bodem).
2. isolatie en de cultuur van gedifferentieerde RPE cellen
- Verwijder het medium van de differentiatie, wassen met PBS, voeg 1 mL 0,05% trypsine plus 1 U/µL van collagenase in elk putje, Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-30 min. verwijderen de trypsine/collagenase en zachtjes, voeg 2 mL van voorverwarmde RPE medium in elk putje van de plaat 6-well (< C0 > tabel 2).
Opmerking: Gebruik een omgekeerde Microscoop om te controleren van de morfologie van de hPSC-RPE-cellen, die vóór de behandeling van de trypsine/collagenase veelhoekige, en ronde na voldoende spijsvertering. -
Het gebruik van een bunsenbrander met pull glas Pasteur pipettes.
- Met beide handen, houdt een lange (9 inch) Pipet van Pasteur aan beide uiteinden zodat er horizontale en boven de Bunsenbrander ongeveer 2/3 van de lengte van het dunne deel van de pipet.
- Zodra het glas zachte van de vlam wordt, snel Trek de twee kanten uit elkaar, zodanig dat een micro schraper-achtige tip wordt gevormd op het nieuwe einde van de Pipet (Figuur 2).
- Herhaal meerdere keren maken meerdere "cel schrapers". Spray de getrokken pipetten met 70% ethanol voor sterilisatie en ze drogen in de cel cultuur kap.
-
Onder een Microscoop, gebruik een micro "cel schraper" zachtjes verwerpen gepigmenteerde hPSC-RPE clusters van de plaat.
- Zachtjes Tik (doen niet schrapen) direct op de gepigmenteerde cellen, die wordt een zwevende werkbalk omhoog in het kweekmedium zodra ze van de bodem van de put distantiëren.
- Onmiddellijk kunt een 20 µL micropipet zachtjes zuignap van de cellen gedissocieerde hPSC-RPE en overbrengen naar een vooraf gecoate 6-well plaat met RPE middellange24.
- ~ 5 x 103 cellen (~ 10% confluentie zoals waargenomen onder een Microscoop X 20) verzamelen in elk vooraf gecoat goed van een 12-well plaat door herhalende stappen 2.3.1–2.3.2 meerdere malen, indien nodig. Breng het eindvolume van medium tot 2 mL.
Opmerking: Om te voorkomen dat gedissocieerde hPSC-RPE cellen zwevend weg, Vermijd beweging van de platen tijdens het dissociatie zodanig dat de gedissocieerde cellen in het medium zweven, maar nog steeds lokaal geconcentreerd.
- Cultuur de nieuwe geïsoleerde hPSC-RPE cellen (P,0) op 12-Wells-platen in RPE medium voor een ander 6-8 weken te laten vormen een gepigmenteerde enkelgelaagde (Figuur 1 c).
- Wijzigen van het medium 3 x / week. Bij het wijzigen van het medium, laat ongeveer 1/3 deel van het oude medium in elk putje en 2/3 volume verse, voorverwarmde RPE medium toevoegen. In dit stadium 2 mL van RPE medium te gebruiken voor elk putje in een 12-well-plate (dus wisselen 1.3 mL medium elke keer).
Opmerking: De enkelgelaagde P0 hPSC-RPE cellen kan uitmaken koepels, suggereren dat de cellen actief van vloeistoffen transport zijn, en door strakke kruispunten25zijn verankerd. Daarom is koepel vorming een indicator van volwassen RPE status.
3. RPE lot validatie door Immunoblotting
- Maak de cel hPSC-RPE lysate met behulp van zoogdieren afkomstig eiwit extractie buffer aangevuld met proteïnase inhibitor cocktail. Incubeer de cel lysate op ijs voor 30 min vóór centrifugeren bij 13.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C tot het negeren van onopgeloste cel puin. Meet de totale eiwitconcentratie van lysate.
- Denatureren van 40 µg totaal eiwit in Laemmli SDS monster buffer bij 75 ° C voor 10 min. het eiwit scheiden monsters op een 10% Tris-glycine SDS-pagina gel bij een constante spanning van 90 V voor 15 min en dan 150 V tot de voorste regionen van kleurstof de onderkant van de gel.
- Overdracht van de eiwitten op een membraan van het nitrocellulose in vooraf gekoelde Tris-glycine buffer aangevuld met 10% methanol bij 100 V gedurende 1 uur.
- Het blokkeren van het membraan in Tris gebufferde zoutoplossing met 0,1% niet-ionogene wasmiddel (TBST) en 5% non-fat droge melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer het membraan met primaire antilichamen verdund in de blokkeerbuffer bij 4 ° C's nachts. Verdun de antilichamen gericht op RPE specifieke marker eiwitten als volgt: RPE65, 1:1 000; CRALBP, 1:1 000; BEST1, 1:1, 000. Verdun het antilichaam tegen β-actine op 1:10,000 te detecteren van β-actine als een besturingselement laden.
- Het wassen van het membraan met TBST 3 keer, met 5 min. voor elke wasbeurt.
- Het membraan met fluorophore geconjugeerd geit-antimuis IgG secundair antilichaam verdund 1:10,000 in de blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
- Het wassen van het membraan met TBST 4 keer, met 10 min. voor elke wasbeurt.
- Detecteren van de eiwitten via een infrarood imaging systeem (Figuur 3).
4. controle van de BEST1 Subcellular Localisatie van immunokleuring
- HPSC-RPE cellen met 2 mL PBS keer wassen en op te lossen in 2 mL zuiver 4% paraformaldehyde gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen met 2 mL PBS tweemaal, en de cellen in 2 mL PBS met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof en 2% ezel serum voor 45 min voor het blokkeren van de aspecifieke bandplaatsen uit te broeden.
- Incubeer de cellen met BEST1 antilichaam (1:200 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- De cellen met 2 mL PBS 3 keer wassen. Incubeer met fluorophore vervoegd secundaire IgG (1:1, 000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen met 2 mL PBS 3 keer voor het verwijderen van niet-afhankelijke secundair antilichaam.
- Observeren gekleurde cellen door confocale microscopie (Figuur 4).
5. opname Ca2 +-afhankelijke Cl- -stroom in hPSC-RPE door geheel-cel Patch-Clamp
- 24-72 uur voordat de patch-klem, split een volledig confluente goed (op een 12-well-plate) voor volwassen P0 hPSC-RPE cellen (geplaveide-vormige en gepigmenteerde). De middellange, wassen eenmaal met PBS gecombineerd en voeg 1 mL 0,05% trypsine plus 1 U/µL collagenase in de put.
Opmerking: Vooraf warm de trypsine/collagenase tot 37 ° C vlak voor gebruik. - Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten.
Opmerking: Na deze stap, de hPSC-RPE cellen zijn nog steeds aanhangend en aangesloten. - Voorzichtig wassen de cellen uit de plaat met een micropipet van 1 mL en cellen in het mengsel spijsvertering overbrengen in een conische tube van 15 mL. Wassen van de put met 1 mL voorverwarmde trypsine/collagenase te verzamelen van de resterende cellen en hen te combineren in de conische tube van 15 mL.
Opmerking: De hPSC-RPE-cellen zijn op dit punt nog steeds in grote klontjes. Probeer niet te breken van de cel klontjes door krachtig pipetteren. Enkele klontjes kunnen vasthouden aan de binnenwand van de tip 1 mL. - Incubeer de conische buis in een droge bad van 37 ° C gedurende 8 minuten.
- Gebruik een micropipet van 1 mL met pipet zachtjes en neergaande 10-15 keer de spijsvertering mix.
Opmerking: Cel bosjes veel kleiner maar nog steeds zichtbaar geworden. Vermijd krachtig pipetteren. - Herhaal de vorige twee stappen.
Opmerking: Allermeest naar de cellen moet in eencellige schorsing na pipetteren. Er kunnen nog enkele kleine cel bosjes, die aanvaardbaar zijn. Optioneel: Incubeer de conische buis bij 37 ° C gedurende een extra 5 minuten gevolgd door zachte pipetteren. De totale tijd in de trypsine/collagenase bij 37 ° C mag niet meer dan 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Voeg 5 mL van voorverwarmde RPE medium aan de conische tube van 15 mL, met de cellen die verteerd. Spin bij 200 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de cellen. Resuspendeer en zaad cellen op vooraf gecoate 35 mm gerechten op 10 – 20% confluentie (bijv., een 100% confluente goed op een 12-well plaat aan vijf 35 mm gerechten voor 10% confluentie).
Opmerking: Te allen tijde vermijden krachtig pipetteren, die aanzienlijke celdood kan veroorzaken, zoals vertegenwoordigd door schijnbare donkere cel puin in het supernatans dat na het centrifugeren. Goed gescheiden eencellige zaaien is essentieel voor patch klem opname. - Uitvoeren van de patch geheel-cel klem zoals eerder beschreven18,26,27,28,29,30,31. Verwerven van de huidige sporen uit een familie van stap potentieel (-100 tot + 100 mV van een bedrijf potentieel van 0 mV) (Figuur 5).
Opmerking: De recepten van interne en externe oplossingen worden beschreven in tabel 3 en tabel 4, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De meest technisch uitdagende stap is de handmatige isolatie, die streeft naar een hoge zuiverheid van een gedifferentieerde P0 hPSC-RPE bevolking. Na een succesvolle isolatie, > 90% cellen in de P0 bevolking zal groeien en volwassen om handtekening RPE morphologies (Figuur 1 c) weer te geven. Het bestaan van een kleine gedeelte van niet-RPE of onrijpe RPE cellen in de P0 bevolking is bijna onvermijdelijk, maar zal niet interfereren met de downstream experimenten, zolang het aantal gepigmenteerde en geplaveide-vormige hPSC-RPE cellen de overweldigende is meerderheid.
Met de aanpak van de ziekte-in-a-schotel hPSC-RPE gebaseerd, kan elke patiënt-specifieke BEST1 mutatie worden uitgebreid gekenmerkt in vivo voor haar eiwit expressie (immunoblotting, Figuur 3), handel () membraan immunokleuring, Figuur 4), en ion kanaal functie (geheel-cel patch klem, Figuur 5). Deze resultaten zullen kritische informatie verschaffen voor het ophelderen van de pathologische mechanismen van het kanaal mutaties, en voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde geneeskunde.
Als BEST1 voornamelijk in RPE cellen uitgedrukt is, kan het worden gebruikt als een cellulaire merker voor de validatie van een volwassen RPE-status. Opgemerkt moet worden dat sommige mutaties BEST1 invloed kunnen zijn op haar eiwit expressie, zodat andere gevestigde RPE markeringen zoals RPE65 en CRALBP nog moeten worden geëvalueerd (Figuur 3).
Gerijpte P0 hPSC-RPE cellen kunnen worden gehandhaafd voor 2-3 maanden vóór de splitsing (naar P1) voor geheel-cel patch klem. P0 cellen ouder dan 3 maanden zijn niet aanbevolen voor patch klem maar kunnen nog steeds worden gebruikt voor immunoblotting en immunokleuring experimenten.
Figuur 1: gedifferentieerde hPSC-RPE cellen in verschillende stadia. Representatieve beelden van gepigmenteerde hPSC-RPE clusters in cultuur platen op eerste verschijning (A), voor isolatie (B), en na de groei naar volwassenheid post isolatie (C). Eye-view en 20 X fase contrast beelden worden weergegeven in de bovenste en onderste panelen, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatief beeld van de micro cel schraper getrokken uit een pipet van Pasteur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: validatie van de volwassen RPE status van gedifferentieerde hPSC-RPE cellen door immunoblotting. Blots de expressie van RPE-specifieke eiwitten markers, BEST1, RPE65 en CRALBP in WT hPSC en hPSC-RPE cellen tonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: immunokleuring van BEST1 in WT hPSC-RPEs. (A) representatieve immunefluorescentie afbeeldingen tonen de lokalisatie van de membraan van WT BEST1 in kasseien-vormige hPSC-RPE cellen. (B) immunokleuring negatieve controle de BEST1 primair antilichaam weglaten.
Figuur 5: geheel-cel patch klem opnames van hPSC-RPEs. (A) A één hPSC-RPE cel voor geheel-cel patch klem. (B) vertegenwoordiger huidige sporen opgenomen van een BEST1 WT hPSC-RPE en een BEST1 gemuteerd hPSC-RPE op piek Ca2 +. De spanning-protocol dat wordt gebruikt om stromingen te ontlokken wordt weergegeven in het Insert. Schaal bar = 1 nA, 150 ms. Zie tabellen 3 en tabel 4 voor patch klem voorbereiding details. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Bedrag |
| Knock-Out (KO) DMEM | 500 mL |
| KO serum vervanging | 15% (75 mL) |
| Niet-essentiële aminozuren | 1% (5 mL) |
| Glutamine | 1% (5 mL) |
| Penicilline-streptomycine | 1% (5 mL) |
| Nicotinamide | 10 mM |
| Menselijke activin-A * | 100 ng/mL |
| * De menselijke activin-A wordt aangevuld gedurende 15-28 dagen van het differentiatie-protocol. | |
Tabel 1: RPE differentiatie Medium.
| Reagens | Bedrag |
| MEM (α wijziging) | 500 mL |
| Foetale runderserum | 5% (25 mL) |
| N1-aanvulling | 1% (5 mL) |
| Glutamine-penicilline-streptomycine | 1% (5 mL) |
| Niet-essentiële aminozuren | 1% (5 mL) |
| Taurine | 125 mg |
| Hydrocortison | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
Tabel 2: RPE kweekmedium.
| Reagens | Concentratie |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnesium ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varieert |
| Glucose ** | ~ 5 mM |
| * Toevoegen CaCl2 om te verkrijgen van de gewenste Ca2 + concentratie | |
| ** Gebruik glucose om te passen osmolariteit tot 290-295 mOsm/L | |
Tabel 3: Patch klem interne oplossing.
| Reagens | Concentratie |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| Glucose * | ~ 5 mM |
| * Gebruik glucose aan te passen aan 300-305 mOsm/L. osmolariteit | |
Tabel 4: Patch klem externe oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste procedure voor de ziekte-in-a-schotel-benadering is om te onderscheiden van hPSCs met een ziekte-veroorzakende mutatie naar de juiste cel bloedlijn, oftewel RPE voor BEST1. Dus, na elk experiment van differentiatie, de resulterende hPSC-RPE-cellen moeten worden zorgvuldig gevalideerd voor hun volwassen status RPE-specifieke morphologies en eiwit markeringen16,17,18. U wilt minimaliseren klonale artefact, moeten meerdere hiPSC klonen uit de dezelfde patiënt of meerdere hESC klonen met de dezelfde mutatie waar mogelijk worden gebruikt.
Zowel hiPSC als hESC lijnen kunnen worden gedifferentieerd naar RPE met hetzelfde protocol. hiPSCs met of zonder een mutatie in het gen BEST1 kunnen worden geherprogrammeerd uit de huid fibroblasten van BEST1 patiënten of gezonde donoren, respectievelijk. hESCs dragen van een mutatie in BEST1 kan worden genetisch gemanipuleerde uit de ouderlijke hESC lijn, die de BEST1 van de wild-type (WT heeft). De hiPSC-RPE en hESC-RPE routes hebben hun eigen voor- en nadelen. De eerste is meer patiënt-specifieke en klinisch relevant, met name voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het is echter vermeldenswaard zijn er enkele beperkingen voor de aanpak van de hiPSC-RPE: 1) er logistiek moeilijk toegang krijgen tot een volledig spectrum van BEST1 patiënt monsters, zoals donaties van patiënten niet altijd gehonoreerd kunnen worden, en sommige mutaties zeer zijn zeldzaam in de eerste plaats; 2) niet-specifieke fenotypen kunnen voortvloeien uit verschillende genetische achtergronden en lichamelijke toestand van de donors; 3) de hiPSC RPE differentiatie efficiëntie varieert voor verschillende donoren, zodanig dat sommige gevallen kunnen technisch lastig te verkrijgen hiPSC-RPEs. Aan de andere kant, de hESC-RPE route, hoewel meer kunstmatige, biedt een veelzijdig platform voor het genereren van isogene hESC-RPEs met gewenste mutaties op aanvraag voor niet-vooringenomen functionele onderzoeken.
Volwassen RPE cellen zijn gepigmenteerde, veelhoekige en verbonden door strakke kruispunten in een enkelgelaagde. Na de splitsing in een enkele cel bevolking voor patch-clamp, zal de vers reseeded hPSC-RPE cellen verliezen de veelhoekige vorm, maar nog steeds behouden pigmentatie voor meerdere dagen (figuur 5A). Patch-clamp is uitgevoerd 24-72 uur na de splitsing van de cel, gedurende welke tijd de pigmentatie kan nog steeds worden gebruikt als een zichtbare marker cellen met goede RPE status selecteren. Een zachte cel splitsen resulterend in een meerderheid van goed gescheiden afzonderlijke cellen zonder aanzienlijke celdood is de sleutel tot het succes van de klem van de patch.
Verschillende andere differentiatie protocollen met verschillende cel cultuurmedia en groeifactoren zijn gedocumenteerd in de literatuur21,32. De tijd die nodig is voor differentiatie van hPSC aan RPE is vergelijkbaar in alle van deze protocollen met inbegrip van ons, terwijl het is moeilijk te zeggen als er significant verschil in de efficiëntie van de differentiatie zonder een side-by-side vergelijking. Opgemerkt moet worden dat in het huidige protocol, hPSC-RPE cellen worden gekweekt in gewone vlakke bodem platen maar niet op de platen met membraan inzetstukken, zodat de hPSC-RPE gegenereerd door deze procedure kan best niet recapituleren de polariteit van RPE in vivo cellen. De technieken die hierboven beschreven zijn daarom vooral geschikt in een onderzoek instelling33, hoewel de gegenereerde hPSC-RPE cellen kunnen ook worden gekweekt in Transwell platen naar formulier enkelgelaagde RPE bladen voor klinische doeleinden17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
