小鼠肾小球疾病模型肾脏功能的评价

所有的实验都是按照英国立法和当地道德委员会的批准进行的。动物研究被布里斯托尔大学研究伦理学委员会批准。 1. 尿白蛋白肌酐比值 (uACR) 注: uACR 用于评估 GFB 对白蛋白的渗透性。尿液中白蛋白的存在表明 GFB 的通透性增强, 它被规范化为肌酐, 以控制尿液流速的变化。蛋白尿是慢性肾脏疾病的常见标记。 在实验基线和定期 (每周一次每月一次) 收集尿液直到实验终点。 用水和浓缩饮食建立老鼠代谢笼。在一个安静的房间里, 将老鼠 (雄性, 6-8 周) 放在单独的笼子里6小时。 将老鼠送回正规的住房, 从空笼子里收集尿液。至少需要50µL。注意: 如果鼠标在给定的时间内不产生尿液, 在温暖的房间里再重复一天。 将尿液在 500 x 克上离心10分钟. 收集尿液并保留沉淀物以评估足细胞损失。在这一点上, 短期内储存尿液在-20 摄氏度。 将尿液稀释成1% 牛血清白蛋白 (BSA) 在1x 的三个缓冲生理盐水 (tb pH 值 7.5), 在1:500 到1:10000 的稀释, 取决于蛋白尿的严重性。注: 端卷应 > 400 µL. 优化, 以确定在每个时间点的正确稀释。 根据制造商的说明, 使用小鼠白蛋白酶联免疫吸附试验 (ELISA) 量化尿白蛋白浓度。 简要地, 为蛋白质结合被优选的 ELISA 板材, 与100µL 抗鼠白蛋白初级抗体 (10 µg/毫升在 0.5 M 碳酸盐-碳酸氢钠 pH 值 9.6) 为 1 h 在室温下。 用 1x tb 加0.05% 吐温 (pH 8.0) 从水井中冲洗过量的抗体, 并在室温下一夜之间添加200µL 的阻塞溶液 (1x tb, 1% BSA pH 值 8.0)。 洗涤板材五次并且增加100µL 标准 (系列稀释: 2000 µg/毫升到15.63 µg/毫升在 1x tb 与 1% BSA, pH 8.0), 空白和稀释的样品三份。在室温下留1小时, 然后洗盘子五次。 添加100µL 检测抗体的每一个井 (10 ng/毫升在 1xTBS 1% BSA, pH 8.0) 和孵化在室温为 1 h。 洗盘子五次, 并添加100µL 的酶基质溶液的每一个井。留在黑暗中的板块, 以发展15分钟, 并停止反应通过添加100µL 0.18 米硫酸 (H2如此4)。注意: H2, 所以4是腐蚀性的。 通过阅读 450 nm 的吸光度法测定每个样品的白蛋白浓度。使用标准曲线来量化每个样本中存在的白蛋白。如果技术重复的 CV 值大于 5%, 请重复这些示例的检测。 另外, 用电泳法评估尿白蛋白浓度。添加5µL 4x 蛋白样品加载缓冲区到15µL 尿。加热样品到95摄氏度10分钟, 然后载入一个 4-12% 三个预制凝胶。 运行的凝胶在 100 V 和染色一夜之间考马斯蓝色每个制造商的协议。 在对凝胶进行成像后, 使用密度测定法来评估折叠改变白蛋白浓度相对于控制。注: 如果在预期的情况下没有观察到白蛋白的波段, 则评估尿液的蛋白质浓度并调整添加到凝胶中的尿量。 稀释2O 1:1, 1:5, 1:10 的生尿样本。注: 端卷应 > 70 µL. 优化, 以确定每个样品的正确稀释。 根据试剂盒说明, 定量测定尿肌酐浓度。简单地, 20 µL 肌酐标准, 空白, 或稀释尿液到96井板三份。 在添加酸溶液之前和之后, 通过阅读 490 nm 的吸光度来确定每个样品的肌酐浓度 (注意, 腐蚀性; 避免接触皮肤)。注: 吸光度值的差异与每个样品中的肌酐浓度成正比。标准曲线是从标准生成的。如果技术重复的 CV 值大于 5%, 请重复这些示例的检测。 生成 uACR (µg/毫克)。将数据规范化为每个鼠标的基线值以进行图形表示。 2. 组织和血液收集 注: 肾脏和肾小球组织可用于评估肾脏疾病的结构、蛋白质和 mRNA 表达标志物。血液可以用来评估肾功能的标志物, 如肌酐, 可以在肾脏疾病中调节, 表明肾小球的过滤能力降低。 准备以下解决方案: 新鲜2.5% 戊二醛在 0.1 M 钠常使用 (pH 7.3), 4% 多聚甲醛在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 哺乳动物响铃的解答 (115 毫米氯化钠 (氯化钠), 10 毫米乙酸钠 (CH3COONa), 1。2mM 磷酸钠 (Na2HPO4), 25 毫米碳酸氢钠 (NaHCO3), 1.2 毫米硫酸镁 (MgSO4), 1 毫米氯化钙 (CaCl2), 5.5 毫米 D (+) 葡萄糖, pH 7.4) 与 1% BSA 和 1x PBS。注意: 2.5% 戊二醛: 毒性, 敏性, 刺激性;在通风柜中使用。0.1 米常使用钠: 有毒, 在通风柜中使用。4% 粉煤灰: 固定剂, 在通风柜中使用 准备以下材料: 异氟醚, 小四乙酸乙稀酸 (edta) 涂层管, 23-25G 针, 5 毫升 EDTA 涂层注射器, 10 毫升玻璃瓶, 10 毫升塑料瓶, 0.5 毫升塑料管, 一次性组织模具, 干冰, 液体 N2、鼠标手术工具及最佳切割培养基 (OCT)。 将鼠标置于深度麻醉下, 通过使用异氟烷腔或类似的末端麻醉路线 (戊巴比妥, 50 毫克/千克) 验证鼠标对脚垫的针头刺不敏感。腹腔 [IP];avertin, 240 毫克/千克 IP), 或二氧化碳 (co2) 曝光 (75% CO2/25% O2)。 通过心脏穿刺将鼠标剔除到左心室并收集尽可能多的血。转移到 EDTA 涂层的血管高达4小时。如果首选, 小鼠可以通过颈椎脱位, 并注意不要破裂颈静脉。 解剖出肾脏通过腹部和洗涤在冰冷的 1x PBS。 检查皮质肾小球, 取出一根肾脏皮质, 切成1毫米3片。为了检查深邻髓小球, 重复同一技术与组织从髓质。放置在5毫升2.5% 戊二醛溶液在玻璃 EM 瓶。存储在4摄氏度。注意: 2.5% 戊二醛溶液: 毒性、敏性、刺激性;在通风柜中使用注: 在1月内进行处理, 以取得最佳效果。 对于组织学, 移除肾脏的上第三, 以确保皮质和邻髓内的肾小球将存在, 并修复5毫升4% 多聚甲醛在4摄氏度 24 h. 转移到5毫升70% 乙醇24小时, 然后再嵌入石蜡。警告: 4% 粉煤灰: 固定剂, 在通风柜中使用 对于免疫荧光, 放置第三个肾脏, 以确保皮质和髓质肾小球将存在, 进入组织模具和大衣在 OCT. 放置在干冰结冰和贮存在-80 摄氏度。 对于蛋白质和 RNA, 放置 3 x 2 毫米3块的肾皮质成0.5 毫升塑料管和在液体 N2冷冻。存储在-80 摄氏度。为 rna 的长期组织存贮, 放置组织在5容量 rna 稳定溶液并且存放在-80 °c。 为了隔离肾小球, 切片其余的肾脏组织和放置在5毫升的哺乳动物响铃的解决方案与 1% BSA 在冰上。准备立即筛肾小球。 3. 血浆肌酐 注: 血浆肌酐可在肾脏疾病中调节, 表明肾小球的滤过能力降低。血尿素氮 (包子) 水平也可以评估, 虽然该协议没有说明这里。 离心血液样本在 500 x g 15 分钟在4摄氏度。 收集血浆, 在这一点可以在短期内储存在-20 °c。 用化学肌酐法定量分析1.11 号议定书中尿肌酐的血浆肌酐浓度。 在加入酸溶液之前和之后, 用 490 nm 的吸光度法测定每个样品的肌酐浓度。注: 这些吸光度值的差异与每个样品中的肌酐浓度成正比。标准曲线是从标准生成的。如果技术重复的 CV 值大于 5%, 请重复这些示例的检测。 4. 分离肾小球 注意: 肾小球可以被隔离来评估个体肾小球的通透性, 以及肾小球疾病特异蛋白和 mRNA 标志物的表达。 把肾脏组织放置在哺乳动物响铃的解决方案与 1% BSA 和解剖的肾小球使用标准筛分技术13。简单地, 堆叠70µm (底部), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm, 425 µm (顶部) 筛子上的玻璃烧杯。 用注射器柱塞将肾脏捣碎成425µm 筛, 并通过使用 1% BSA 的冷哺乳动物响铃溶液进行推入。当肾脏的位被推挤, 去除顶部筛子并且继续做同样在下。重复直到只有100µm 和70µm 筛保持。 将100µm 和70µm 筛保留的肾小球收获转移到10毫升的新鲜哺乳动物响铃的解决方案与 1% BSA, 在冰上。注: 如果每毫升的肾小球的数量是很少的, 减少的铃声的解决方案的数量用于收集肾小球从最后两个筛子。 将含有肾小球的溶液的5毫升移除到两个单独的管 (2.5 毫升) 和离心机 1000 x g 10 分钟4摄氏度。移除上清液, 在液体 N2中将肾小球冷冻, 然后在-80 °c 存储蛋白质和 RNA 后再进行提取。 将含有肾小球的剩余溶液放置在37摄氏度的水浴中, 用于测量肾小球 Lpa/Vi.型完成3小时内取出肾脏。 5. 肾小球水渗透率 (升p/Vi) 注: 肾小球 Lp-A/Vi . 型测定能快速重现性地测定单个肾小球的渗透性。肾小球 LpA/V 的增加表明 GFB 的破坏, 这是肾脏疾病的暗示。 按照鲑鱼et10的描述, 设置肾小球 LpA/V。有关设置的详细图表, 请参阅图 1 。 准备以下解决方案: 哺乳动物响铃的解决方案与 1% bsa (ph 7.4) 和哺乳动物响铃的解决方案与 8% BSA (ph 7.4)。温暖两到37°c。 从玻璃毛细管 (光学密度: 1.2 毫米) 拉 micropipettes。通过在显微镜下切割微, 产生 5-8 µm 孔径尖端。 使用肾小球 LpA/V我的钻机, 以捕捉完整的个别肾小球, 没有鲍曼的胶囊和管状碎片上微使用吸力。oncometric 化验的详细摘要见鲑鱼et al10。简而言之, 一旦肾小球被捕获并固定在吸入微上, 就开始在显微镜下记录肾小球的视频。 首先, 平衡在1% 波塞军的解决方案中的肾小球在三十年代切换 perifusate 到集中 8% BSA 的解决方案十年代。然后切换 perifusate 回到 1% BSA 的解决方案, 并停止录音。 把肾小球洗掉, 每只老鼠重复 10-15 肾小球的过程。确保 perifusate 流速相同, 不能快速 (10 毫升/分钟), 以免扭曲肾小球结构。 测量肾小球收缩的初始速率, 计算肾小球的水渗透性 (LpA) 正常化为肾小球容积 (Vi.)。关于分析的详细信息可以在鲑鱼et al10中找到。 6. 周期性酸希夫 (PAS) 染色 注意: PAS 染色将突出肾小球毛细血管循环和管状上皮的基底膜。它使肾小球细胞、系膜基质和潜在扩张的详细可视化, 以及肾小球的潜在变化 (即增厚和不规则)。 切片的石蜡嵌入, 粉煤灰固定的肾皮质使用切片在5µm 厚度的聚 l-赖氨酸涂层幻灯片。干燥在37°c 为 1 h. 确保该节不包含任何褶皱或孔, 这会扭曲显微镜下的形态学。 Deparaffinize 通过孵化两次在二甲苯 (警告, 刺激性; 在通风柜中使用) 每3分钟, 两次在100% 乙醇3分钟, 然后一次在 95%, 70%, 50% 乙醇每一个3分钟, 所有在室温下。重新水合 dH2O 的幻灯片。 在周期酸性溶液中孵化幻灯片 (注意, 刺激性; 在通风柜中使用) (1 克/dL) 5 分钟, 然后冲洗在 dH2的几个变化中的幻灯片, 在室温下使用100毫升 dH2O 的容器。注意: 周期性酸溶液: 刺激性;在通风柜中使用 在室温下, 用希夫试剂 (Parasoaniline 盐酸6克/升和焦亚钠0.25 摩尔/升) 孵化出15分钟的切片。在自来水中冲洗幻灯片5分钟。 Counterstain 与苏木精为 3 s, 然后彻底冲洗运行自来水的幻灯片15分钟。注意: 可能需要进行一些优化, 以确定最佳的苏木精染色时间。 在步骤6.2 中使用 deparaffinization 协议的反向脱水幻灯片。用二甲苯完成。 空气干燥幻灯片和装载以二甲苯为基础的安装介质。 光学显微镜下的图像, 以400X 倍的比例来评估肾小球结构。评估如下: 肾小球的增厚和不规则, 毛细血管循环的瓦解, 纤维化组织, 硬化, 细胞增殖 (内皮, 足细胞和系膜, 或炎症细胞浸润簇)。注: 对于肾小球病理生理学的综合评估, 应评估肾脏其他部位的病变, 如小管。 7. 透射电镜 (TEM) 注意: TEM 允许检查肾脏的超结构异常, 如肾小球、足细胞足过程和内皮 fenestrations, 这些都是光镜看不到的。这在肾脏损害不那么明显的模型中很重要 (即没有蛋白尿和主要结构异常)。 采取 2.5% gluteraldehdye 固定的肾切片和后修复在1% 锇毒气1小时, 50 毫升0.1 米常使用缓冲 (pH 7.3), 然后50毫升的 dH2O (3 x 15 分钟的变化)。注意: 2.5% 戊二醛: 毒性, 敏性, 刺激性;在通风柜中使用。0.1 米常使用钠: 有毒, 在通风柜中使用 乙醇脱水, 嵌入 Araldite 树脂。 用 3% (水) 醋酸铀和雷诺铅柠檬酸盐溶液切割出 50-100 nm 厚度和染色的切片。 在940X、1250X 和6200X 的肾小球的几个区域进行数字显微照片, 以确保足、GEnCs、肾小球和系膜能被识别出来。 用 ImageJ 分析盲肾小球。通过在已知距离的两个点 (如标尺) 之间绘制线条, 为每个6200X 显微图像设置刻度。转到 “分析”, 然后设置 “缩放”, 在该行的长度将以像素为单位显示。键入已知距离和度量单位。使用下面列出的协议来测量每个参数。注意: 此分析要求每只鼠标大约1天。为了获得足够的统计能力, 使用来自3只小鼠的3肾小球的平均测量值。 对于肾小球, 在6200X 显微图像上插入一个固定的数字网格 (10 x 10), 并测量网格线穿过该格子的点的厚度。用直线工具测量从基底内皮细胞膜到基底足细胞足部过程细胞膜与内皮细胞膜的垂直切线。确定每个肾小球的平均测量从10个单独测量。 对于内皮细胞的开窗次数, 测量6200X 显微图像中的 fenestrations 的长度, 并计算每单位长度的肾小球的内皮细胞数。平均每肾小球至少4显微照片。 对于足细胞脚加工宽度, 在6200X 显微图像上插入固定数字网格 (10 x 10)。测量跨越网格线的足细胞脚进程的宽度。测量在最宽的部分的脚的过程中, 它满足的肾小球的宽度;确保线垂直于足细胞基底膜的切线。确定每个肾小球的平均测量从10个单独测量。 对于足细胞狭缝宽度, 在6200X 显微图像上插入固定数字网格 (10 x 10)。测量穿过网格线的足细胞狭缝隔膜的宽度。这是脚的过程是最接近的地方, 在每个脚过程最宽的部分, 从足细胞膜到膜。确保测量垂直于足细胞基底膜的切线。确定每个肾小球的平均测量从10个单独测量。 对于足细胞脚的数量, 测量在6200X 显微图像中存在的足细胞的长度, 并计算每单位长度的肾小球的数量。平均每肾小球至少4显微照片。 对于亚足细胞空间覆盖率, 请参见尼尔et的详细方法。14。 使用940X 显微照片, 检查肾小球的存在异常结构, 沉积, 并通过眼睛浸润。 8. 足细胞和内皮标记物的免疫荧光 注: 染色允许可视化的蛋白表达模式, 如内皮毛细血管循环, 这可能崩溃的肾小球疾病。 将含有冰冻肾脏的 OCT 模具放置在切片前2小时-20 摄氏度。确保将肾脏切开的表面小心地放置在 OCT 模具的底部, 以使组织切片能够很好地定位。 使用恒温器, 切片组织在5µm 厚度到聚 l-赖氨酸涂层的幻灯片。注意: 确保组织部分没有褶皱或孔洞, 这会扭曲形态学。 从恒温器中取出后, 将4% 个粉煤灰中的幻灯片固定在10分钟内, 在一个容器中用100毫升的 dH2O 来清洗幻灯片 3 x 5 分钟。警告: 4% 粉煤灰: 固定剂, 在通风柜中使用 为了最大限度地减少使用的抗体量, 用疏水性笔绘制周围的部分。不要让切片干燥。 在室温下, 在 1x PBS 中孵育 (3% BSA 和5% 正常血清) 1 小时。 用一个吸引和孵化部分去除与主要抗体 (Nephrin, podocin, 或 PECAM-1) 稀释 1:250 (3% BSA 在 1x PBS) 的堵塞解决方案。将幻灯片放在一个湿润的房间, 在4摄氏度过夜。如果潮湿的房间不可用, 轻轻地放置一小条 parafilm 在抗体涂层的幻灯片上。在删除第二天时要小心, 以不中断部分。 在 1x PBS 中清洗幻灯片 3 x 5 分钟。 在黑暗的室温下, 用适当的荧光二级抗体稀释 1:1000 (3% BSA 在 1x PBS 中) 进行孵育2小时。 在 1x PBS 中清洗幻灯片 3 x 5 分钟。安装含有 DAPI 的荧光装入介质。 图像幻灯片与荧光显微镜在400X 放大, 以查看肾小球。确保这是盲目的, 以避免偏见。 使用 ImageJ 分析染色强度, 规范化的肾小球区, 和染色模式,即毛细血管循环的数量正常化到肾小球区, 以盲目的方式。 9. 蛋白质提取和西部印迹 注: 西方印迹允许我们评估已知的表达蛋白失调在肾脏疾病。例如, podocin 和 nephrin 表达式的减少表明足细胞丢失。 从肾皮质和筛过的肾小球中提取蛋白质;该协议是相同的, 每一个, 溶解缓冲量调整的数量的组织。 解冻肾脏/肾小球在冰之前添加 NP-40 裂解缓冲 (150 毫米氯化钠, 1% NP-40, 50 毫米三 pH 8) 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。融汇三十年代的样品。 在冰上孵化均匀的样品30分钟, 涡流定期。 离心样品在 1万 x g 15 分钟在4°c。 将上清液移到冰上的新鲜管子上。注: 预期每样样品恢复大约1毫克蛋白质。 使用标准的 4x Laemmli 缓冲器变性蛋白质。将混合物煮沸 95-100 °c 5 分钟。 评估肾小球细胞标记蛋白 (Nephrin、Podocin、PECAM-1等) 的表达, 以及已知/假设在疾病模型肾脏/肾小球中被改变的蛋白质的磷酸化和表达, 使用西方印迹 (标准方法;马哈茂德和杨15)。注意: 该协议将根据感兴趣的蛋白质的大小和丰度而异。 10. RNA 提取和聚合酶链反应 (PCR) 注意: mRNA 表达分析允许我们确定基因在肾脏疾病中的调控方式, 如基因表达的变化和选择性剪接。 虽然肾脏皮质仍然是冷冻, 彻底研磨3毫升苯酚试剂使用杵和砂浆。如果使用肾小球提取物, 添加1毫升苯酚试剂和融汇样品三十年代。注意: TRIzol 试剂: 刺激性;在通风柜中使用 使用 Chomczynski 和萨基16描述的方法执行 RNA 提取。注意: 商业 RNA 提取套件可作为此方法的替代品。 利用现有的各种方法, 评估获得的 RNA 的数量和质量。RNA 是 aliquoted 和存放在-80 °c 在这一点上。避免重复冻融。注意: 如果新的方法, 检查 rna 的质量, 然后继续下一步通过运行的 rna 琼脂糖凝胶, 以确保一个明确的28S 和18S 核糖体带。预计使用此方法恢复2到5µg 的 RNA。 DNase 治疗1µg RNA (使容量由10µL 与无 RNase 水加上1µL DNase 和1µL 缓冲) 为 1 h 在37°c。停止反应与1µL 的 DNase 停止溶液在65°c 10 分钟。 添加0.5 µL 的寡核苷酸 (dT) 和随机引物。孵育70°c 10 分钟。 立即在冰上淬火5分钟。 添加以下内容;MMLV 逆转录酶 (400 u; 替换为 DEPC H2O 在 RT 控制样品), MMLV 缓冲器 (1x), dNTP 混合 (0.5 毫米) 和核糖核酸抑制剂 (40 U);用 DEPC 水使多达50µL。 孵育反应混合在37°c 1 小时之后95°c 5 分钟停用酶。注: 为了产生更高的 cDNA, 孵化率在37摄氏度, 最高可达3小时。 使用可用的各种方法评估 cDNA 的数量和质量。 应用 PCR 方法评估肾小球疾病模型中失调基因的 mRNA 表达和剪接模式。该协议将根据感兴趣的基因而变化。