Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Menselijke en dierlijke ziekteverwekkers overgedragen door geleedpotigen vectoren zijn wereldwijd te vinden en zijn goed voor ongeveer 20% van de infectieziekten wereldwijd¹, maar effectief en veilig vaccins tegen de meeste van deze ziekteverwekkers zijn niet beschikbaar. Ons begrip van de belangrijke rol van commensale, symbiotische en pathogene micro-organismen, gezamenlijk bekend als de microbiome², moduleren en de vormgeving van de gezondheid van bijna alle metazoans³ groeit. Het is nu duidelijk dat geleedpotigen vectoren van ziekteverwekkers ook darmflora haven en deze vector-geassocieerde microbiota is aangetoond dat de invloed van uiteenlopende vectoren overgedragen ziekteverwekkers^4,5. De geleedpotigen microbiome is samengesteld uit eubacteria, archaea, virussen en eukaryote microben zoals protozoa, aaltjes en schimmels⁶. Echter, de overheersende onderzoek focus is op eubacteria, gedeeltelijk vanwege de beschikbaarheid van markers en verwijzing databases te identificeren specifieke bacteriële leden.

Met een focus op Ixodes scapularis, de teek vector van meerdere menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi⁷, inclusief de verwekker van de ziekte van Lyme, de optimalisatie van een microbiële visualisatie techniek was erop gericht verbetering van ons begrip van de darmflora van de teek in het kader van vector-pathogeen interacties. Verschillende vragen moeten worden beantwoord in de teek microbiome veld. De darm is de site van de eerste uitgebreide ontmoeting tussen de teek en de binnenkomende ziekteverwekker in het kader van horizontaal overgedragen ziekteverwekkers; Daarom is inzicht in de rol van vector darmflora bij het moduleren van vector-pathogeen interacties zal onthullen zinvolle inzichten. Teken hebben een unieke wijze van bloedmeel spijsvertering, waar de verwerking van bloedmeel onderdelen neemt intracellulair⁸plaatsen. Het lumen van de darm schijnbaar fungeert als een vaartuig naar de bloedmeel bevatten als de teek-feeds, en nutriënten spijsvertering en assimilatie blijven na herverpakking voortvloeien gedurende de verschillende dagen van de voeding. De ziekteverwekkers verworven door de teek tijdens het voederen Voer het lumen van de darm samen met de bloedmeel en dus de lumen wordt een primaire site van interacties tussen de teek, pathogenen en resident microbiota. Zoals spijsvertering via de herverpakking en Ixodid teek Rui verloopt, ondergaat de darm structurele en functionele wijzigingen⁹. De samenstelling en de ruimtelijke organisatie van gut bacteriën is ook waarschijnlijk om te variëren in concert met de veranderende milieu van de darm. Het is daarom belangrijk om te begrijpen van de architectuur van verblijvende bacteriën in de darm van de teek om volledig te begrijpen het samenspel van de teek, pathogenen en darmflora.

Moleculaire technieken voor het beschrijven van host-geassocieerde microbiota routinematig gebruik maken van high-throughput parallelle sequencing strategieën¹⁰ volgnummer bacteriële 16S ribosomal DNA (rDNA) te versterken. Deze strategieën sequencing omzeilen de noodzaak tot het verkrijgen van een culturen van specifieke bacteriën en geef een gedetailleerde beschrijving van alle bacteriële leden vertegenwoordigd in de steekproef. Toch zijn dergelijke strategieën verward door het onvermogen om te onderscheiden van milieu verontreinigingen van bona fide bewoners. Verder, bij de beoordeling van de monsters, zoals teken, die in grootte klein zijn en vandaar bevatten lage microbiota-specifieke DNA oplevert, de waarschijnlijkheid van versterking van milieucontaminanten is toegenomen¹¹ en resulteert in de onduidelijke interpretatie van microbiome samenstelling. Functionele karakterisering in combinatie met de visualisatie van specifieke levensvatbare bacteriën zal daarom worden cruciaal voor het definiëren en onderscheiden de microbiome van de teek stoffelijk en ruimtelijk. Richting van dit doel profiteerde we van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie. Deze techniek wordt routinematig gebruikt ter beoordeling van gen expressiepatronen in organen en embryo’s^12,13,14 en kunt semikwantitatieve analyse van meningsuiting via het gehele monster van belang. Dit verschilt van de traditionele in situ hybridisatie technieken die gebruik maken van weefselsecties en vaak uitgebreide analyse van verdeelde materiaal met een computationele vergadering te voorspellen van de expressie in de hele organen¹⁵vereist. Terwijl geheel-mount in het algemeen naar hele organismen^{12 verwijst}, verwijst hier geheel-mount naar hele darmen of organen. De voordelen van het gebruik van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie aanpak om te beoordelen van de architectuur van de teek darmflora zijn multifold. De darm van de teek is samengesteld uit 7 paren van diverticula, elk paar variërend in de grootte¹⁶. De functionele verschillen, vink als iemand, onder deze diverticula, niet in de context van de teek biologie begrepen zijn, microbiota of teek-pathogeen interacties. Manipulaties van de darm die scheuren van de darm diverticula zou verdringen microbiota aanwezig zijn in het lumen van de darm of die losjes gekoppeld aan de darm en verkeerde interpretatie van de ruimtelijke lokalisatie van microbiota. Fluorescentie-geëtiketteerden RNA in situ hybridisatie is eerder gebruikt om te onderzoeken afschriften¹⁷ van de darm van de teek door vaststelling en individuele gut diverticula om sonde hybridisatie en te lokaliseren van B. burgdorferi te openen transcripties door segmenteren van paraffine-ingebedde hele teken¹⁸. Deze beide benaderingen vereisen manipulaties van de weefsels van de teek vóór hybridisatie die afbreuk aan de gut microbiota architectuur doen zou.

In dit verslag beschrijven we in detail het protocol te onderzoeken van levensvatbare teek darmflora met behulp van geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH). Het gebruik van geheel-mount RNA in situ hybridisatie in staat stelt een globaal inzicht in de aanwezigheid en de overvloed van specifieke gut bacteriën in de verschillende regio’s van de darm en kan aansporen nieuwe inzichten in de teek gut biologie in het kader van pathogen kolonisatie en doorgeven. Verder is maakt het gebruik van RNA sondes gericht zijn tegen specifieke bacteriële RNA de ontdekking van levensvatbare bacteriën in de darm van de teek.