Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay
Summary
Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.
Abstract
Regulierte Protein-Protein-Interaktionen sind ein leitendes Prinzip für viele Signalisierung Veranstaltungen, und die Erkennung solcher Ereignisse ist ein wichtiges Element für das Verständnis, wie solche Wege organisiert sind und wie sie funktionieren. Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen zu erkennen, aber relativ wenige können verwendet werden, um Interaktionen zwischen endogenen Proteinen zu erkennen. Eine solche Methode, Nähe Ligatur Assay (PLA), hat mehrere Vorteile, seine Verwendung zu empfehlen. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden der Proteinprotein Interaktionsanalyse, PLA hat relativ hohe Sensitivität und Spezifität, mit minimalen Zelle Manipulation und im Protokoll beschriebenen erfolgen kann, erfordert nur zwei gezielt Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten (zB., von Mäusen und Kaninchen) und eine spezielle Reagenzien: eine Reihe von sekundären Antikörper, die kovalent verknüpfte spezifischer Oligonukleotide sind, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht, erstellen ein amplifiable Plattform für in Situ PCR oder rollenden Kreis Verstärkung. In diesem Vortrag zeigen wir, wie die PLA-Technik, um Änderungen in MST1 und MST2 Nähe in festen Zellen visualisieren anwenden. Die Technik in diesem Manuskript beschrieben gilt vor allem für die Analyse der Zelle Studien.
Introduction
Störung der MST1/Hippo-Signal wurde mit Entwicklungsstörungen und Karzinogenese1verbunden. Bei Säugetieren, die Kinasen MST1 und MST2 aktivieren (phosphorylieren) MOB1 und LATS1/2, von denen die letztere dann phosphorylates und inaktiviert die transkriptionelle Coaktivator ja-assoziierten Protein (YAP)2. In seiner aktiven Form (unphosphorylated) hat YAP Onkogenen Aktivität, Verbesserung der Transkription von Genen Zelle Verbreitung; umgekehrt, wenn YAP durch den Hippo-Weg inaktiviert, Zellproliferation wird unterdrückt und Apoptose gefördert3. In Geweben MST1 und MST2 gibt es hauptsächlich als aktive Homodimers aber Onkogenen Reize MST1/MST2 Heterodimere erhöhen können, und solche Heterodimere sind inaktive4. Wie MST1/MST2 Heterodimerization reguliert wird, bleibt jedoch schlecht verstanden. Homo- und Heterodimere sind vermittelte über Interaktionen zwischen C-terminale coiled-Coil Regionen MST1 und MST2 bekannt als SARAH Domänen5. Über ein in Situ nachgewiesen PLA in diesem Artikel zeigen wir die Anwesenheit von MST1/MST2 Heterodimere im menschlichen Schwann-Zellen (HSC) und menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-293). PLA hat einen Vorteil gegenüber anderen Eiweiß/Protein-Interaktion-Nachweismethoden, weil dadurch die Erkennung von endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen, die identifiziert und quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit des Transgens Ausdrucks oder die Verwendung von Epitop Tags werden können 6.
Transduktion Signalwege sind weitgehend vom bedingte Verband der Komponente Proteine gesteuert. Zum Beispiel führt Stimulation der meisten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Homo oder Hetero-Dimerisierung und anschließende Verbindung mit zusätzlichen intrazellulären Signalproteine, die ihrerseits weitere komplexe Form. Der PLA-Methode soll Nähe zwischen den Proteinen in den Zellen visualisieren unter der Voraussetzung, dass die Proteine weniger als 30-40 nm auseinander. Protein-Nähe in der Regel vom ersten Inkubation der Zellen mit entsprechenden Primärantikörper angehoben in verschiedenen Arten erkannt wird (zB., Hase und Maus) gegen jedes interagierenden Protein, dann Zugabe artspezifische Sekundärantikörper Pre-gekoppelte, kurze DNA-Sonden. Wenn die DNA-Sonden in der Nähe sind, kann eine bestimmte Verknüpfung DNA-Oligonukleotid gleichzeitig sowohl diese Sonden, bilden eine Plattform für die Verstärkung von in Situ PCR oder durch Walzen Kreis Mechanismus binden. Fluoreszierende Tags hinzugefügt, um die Verstärkung Reaktion ermöglichen Visualisierung der interagierenden Proteine, die erscheinen als fluoreszierende Punkte, die leicht zu quantifizieren und lokalisiert auf bestimmte Regionen in der Zelle7,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir fanden es nützlich, Kammer Objektträger für dieses Experiment zu verwenden, wie es sehr praktisch zum Experiment mit mehreren (14-16) Zelllinien durchführen ist und es keine Notwendigkeit gibt, die Probe jedes Mal während der Mikroskopie Analyse ändern. Ein paar Komplikationen auftreten, wie ein erhöhtes Risiko für Cross-Kontamination mit Antikörpern. Daher empfehlen wir waschen jeden gut einzeln anstatt Kanope Coplin, trotz der erhöhten während des Experiments. Darüber hinaus Entfernen von Silikon-Einlag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei der gesamte Chernoff-Labor für Beitrag zur Optimierung und Validierung dieses Protokolls, insbesondere Maria Radu und Galina Semenova. Wir danken auch Andrey Efimov von Cell Imaging Facility am Fox Chase Cancer Center. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem NIH (R01 CA148805) an JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
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