Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese
Summary
Dit protocol combineert de karakterisering van een eiwitsteekproef door capillaire gelelektroforese en een snel-bindende screening voor geladen liganden door affiniteit capillaire elektroforese. Het wordt aanbevolen voor eiwitten met een flexibele structuur, zoals intrinsiek ongeordende eiwitten, om te bepalen van eventuele verschillen in bindende voor verschillende conformeren.
Abstract
Planten zijn sterk afhankelijk van hun omgeving. Om aan te passen aan stressvolle veranderingen (bijvoorbeeld, droogte en hoge zoutgehalte), evolueren hogere planten klassen van intrinsiek ongeordende eiwitten (ontheemden) oxidatieve en osmotische stress te verminderen. Dit artikel maakt gebruik van een combinatie van capillaire gelelektroforese (CGE) en affiniteit elektroforese (ACE) van de verschuiving van de mobiliteit om te beschrijven het bindingsgedrag van verschillende conformeren van de IDP-AtHIRD11 van Arabidopsis thaliana. CGE is gebruikt om te bevestigen de zuiverheid van AtHIRD11 en tot uitsluiting van fragmenten, posttranslationele modificaties, en andere verontreinigingen als redenen voor complexe piek patronen. In dit deel van het experiment, zijn de verschillende monster onderdelen gescheiden door een viskeuze gel binnen een capillair door hun verschillende massa’s en met een diode array detector gedetecteerd. Daarna wordt het bindingsgedrag van het monster naar verschillende metaalionen onderzocht door ACE. In dit geval de ligand is toegevoegd aan de bufferoplossing en de verschuiving in de migratietijd wordt gemeten om te bepalen of een bindende gebeurtenis heeft plaatsgevonden of niet. Een van de voordelen van het gebruik van de combinatie van CGE en aas om te bepalen van het bindingsgedrag van een IDP is de mogelijkheid om de Elektroforese van het gel en de bindende bepaling te automatiseren. Bovendien CGE toont een ondergrens voor detectie dan de klassieke gelelektroforese en ACE vermag bepalen de wijze van bindende een ligand in een snelle manier. ACE kan daarnaast ook worden toegepast op andere geladen soorten dan metaalionen. Het gebruik van deze methode voor het binden van experimenten wordt echter beperkt in zijn vermogen om te bepalen van het aantal bandplaatsen. De combinatie van CGE en ACE kan echter worden aangepast voor het karakteriseren van het bindingsgedrag van een eiwitsteekproef naar talrijke geladen liganden.
Introduction
Planten zijn meer afhankelijk van hun omgeving dan vele andere levensvormen. Aangezien planten niet naar andere plaatsen verplaatsen, moeten ze zich aanpassen aan veranderingen in hun omgeving (bijvoorbeelddroogte, koude en hoge zout concentraties). Daarom ontwikkelde hogere planten gespecialiseerde stress eiwitten zoals dehydrins, die vele taken vervullen ter vermindering van de spanning van de cel aan hoge zoutgehalte gerelateerde. Deze proteïnen binden van water en ionen binnen cellen, vermindering van oxidatieve stress door bindende Cu2 +-ionen, en interactie met fosfolipiden, evenals de cytoskeletons. Bovendien bindend Zn2 +-ionen kan deze eiwitten als transcriptiefactoren op te treden. Hun vermogen om te binden Ca2 +-ionen nadat fosforylatie ook is gemeld1.
De multifunctionele werking van deze proteïnen is gerelateerd aan het ontbreken van hydrofobe aminozuurresidu’s. Zij missen dus een hydrofobe interacties binnen de keten van peptide en ook een beperkte structuur. Echter, omdat deze proteïnen een restrictieve structuur ontbreekt, zij verschillende conformeren onder dezelfde voorwaarden kunnen innemen. Dus kunnen ze beschreven worden best als een ensemble van structuren in plaats van een enkele bevleesdheid. Eiwitten met deze eigenschappen staan bekend als intrinsiek eiwitten (ontheemden ontregelde) en een veelgebruikt concept voor stress-eiwitten en overspraak tussen verschillende trajecten in eukaryote cellen2 zijn.
Een van deze stressgerelateerde ontheemden is AtHIRD11. Het is een van Arabidopsis thalianade meeste zeer droogte-uitgedrukt ontheemden. Vandaar, de verschillende conformeren kunnen worden gescheiden door hun effectieve straal te rekenen verhouding en capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor verder onderzoek. Vorige ACE experimenten aangetoond dat de interactie tussen AtHIRD11 en overgangsmetalen ionen zoals Cu2 +-, Zn2 +– Co2 +en Ni2 +-ionen. De gedetailleerde resultaten kunnen worden gevonden in Hara et al. 3 en Nachbar et al. 4.
De ACE-methode die hier wordt gebruikt is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde werken6. De toevoeging van het EOF marker acetanilide aan de eiwitSteekproef is echter niet geschikt. AtHIRD11 toont brede piek patronen, en de EOF-markering toe te voegen aan het monster twee pieken zou verhullen. De markering wordt daarom gebruikt in een aparte run. Voordat het bindingsgedrag wordt onderzocht, wordt bevestigd dat de pieken gevonden tijdens eerdere experimenten van verschillende conformeren zijn. Dus, CGE is gebruikt om te onderscheiden tussen de eiwit conformeren, de posttranslationele gemodificeerde eiwitten en onzuiverheden, zoals fragmenten van AtHIRD11, door hun verschillende massa’s. Daarna wordt het gekenmerkt AtHIRD11 monster bindingsgedrag naar diverse verschillende metaalionen onderzocht.
Het doel van dit artikel is voor het beschrijven van een experimentele opstelling onderscheid maken tussen een IDP en andere componenten van een monster teneinde de verschillen in het bindingsgedrag van verschillende conformeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor alle CE experimenten is de voorbereiding van het capillair een cruciale stap. Aangezien het een glazen buis met een kleine diameter, kan het gemakkelijk breken op de plekken waar de coating wordt verwijderd wanneer het wordt behandeld. De installatie van het capillair in het instrument moet zeer zorgvuldig gebeuren.
De kritische stappen betrokken bij het gebruik van de ACE-methode voornamelijk betrekking hebben op de experimentele opzet. Een andere belangrijke stap is het vinden van de ju…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij dankbaar dank Masakuza Hara (het Research Institute of Green Science and Technology, Universiteit van Shizuoka, Japan) voor het verstrekken van de AtHIRD11 EiwitSteekproeven.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
