AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi
Summary
Bu iletişim kuralı bir protein örnek karakterizasyonu benzeşme kapiler Elektroforez tarafından kapiller Jel Elektroforez ve hızlı bağlama tarama için şarj edilmiş ligandlar birleştirir. Bu proteinler gibi özünde düzensiz proteinler, esnek bir yapı için bağlama farklı conformers için tüm farklılıkları belirlemek için önerilir.
Abstract
Bitkiler kuvvetle çalışma ortamlarına bağlıdır. Stresli değişiklikleri (Örneğin, kuraklık ve yüksek tuzluluk) düzenlemek için sınıflar proteinlerin oksidatif ve ozmotik stresi azaltmak için özünde düzensiz (YDK) daha yüksek bitkiler gelişmeye. Bu makalede kapiller jel elektroforez (CGE) ve hareketlilik shift benzeşme Elektroforez (ACE) bir arada IDP AtHIRD11 farklı conformers Arabidopsis thalianaüzerinden bağlama davranışını tanımlamak için kullanılmaktadır. CGE AtHIRD11 saflığı onaylamak ve parçaları, ardından değişiklikleri ve diğer kirleri nedenlerden dolayı karmaşık tepe desen olarak dışlamak için kullanılır. Deneme bu bölümünde, farklı örnek bileşenleri viskoz bir jel bir kılcal damar içinde onların farklı kitleler tarafından ayrılmış ve bir diyot dizi bulmak ile tespit. Daha sonra örnek çeşitli metal iyonları doğru bağlama davranışını ACE tarafından araştırıldı. Bu durumda, ligand arabellek çözüme eklenir ve geçiş süresi vardiyada bağlama olay ya da değil oluşup oluşmadığını belirlemek için ölçülür. Jel Elektroforez ve bağlama tahlil otomatikleştirme imkanı CGE ve ACE kombinasyonu bir IDP bağlama davranışını belirlemek için kullanmanın yararları biridir. Ayrıca, bir alt sınırından algılama klasik jel elektroforez CGE gösterir ve ACE hızlı bir şekilde bir ligand bağlayıcı şekilde belirlemek yapabiliyor. Buna ek olarak, ACE metal iyonları daha şarj edilmiş diğer türler için de uygulanabilir. Ancak, deneyler bağlama için bu yöntemin kullanılması bağlama sitesi sayısını belirledikten yeteneği sınırlıdır. Yine de, CGE ve ACE kombinasyonu herhangi bir protein örnek çok sayıda şarj edilmiş ligandlar doğru bağlama davranışını karakterize için adapte edilebilir.
Introduction
Bitkiler daha birçok diğer yaşam formları daha çalışma ortamlarına bağlıdır. Bitkiler başka yerlere hareket edemez beri onlar çevreleri (Örneğin, kuraklık, soğuk ve yüksek tuz konsantrasyonu) değişiklikleri ayarlamak zorunda. Sonuç olarak, yüksek bitkiler özel stres proteinler için yüksek tuzluluk ilgili hücre stres azaltmak için manifold görevleri yerine getirmek dehydrins gibi geliştirilmiştir. Bu proteinler su ve iyonları hücrelerin içinde bind, Cu2 +bağlayarak oksidatif stresi azaltmak-iyonları ve fosfolipitler yanı sıra cytoskeletons ile etkileşim. Ayrıca, Zn2 +bağlama-iyonları transkripsiyon faktörleri hareket etmek bu proteinler sağlar. CA2 +şekilde bağlanabilemeleridir-fosforilasyon da kaldıktan sonra iyonları1bildirdi.
Bu proteinler çok fonksiyonlu davranışını hidrofobik amino asitlerin yokluğu ilgilidir. Sonuç olarak, onlar peptid zinciri ve kısıtlanmış bir yapı içinde hidrofobik etkileşimler eksikliği. Bu proteinler kısıtlayıcı bir yapı eksikliği nedeniyle, ancak, aynı koşullarda farklı conformers kaplayabilir. Bu nedenle, onlar en iyi bir yapılar topluluğu yerine tek bir biçimi olarak tanımlanabilir. Özünde proteinler (YDK) düzensiz ve stres proteinler ve ökaryotik hücreler2farklı yolları arasında çapraz karışma için yaygın olarak kullanılan bir kavram olarak proteinler bu özellikleri ile bilinir.
Bu stres kaynaklı YDK biridir AtHIRD11. Arabidopsis thaliana‘ ın en son derece kuraklık ifade etmektedir biridir. Bu nedenle, farklı conformers oranı şarj etmek için etkili onların RADIUS tarafından ayrılmış olabilir ve kapiller Elektroforez (CE) daha ileri araştırmalar için kullanılan. Önceki ACE deneyler göstermiştir AtHIRD11 ve Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +ve Ni2 +gibi geçiş metal iyonları arasındaki etkileşimler-iyonları. Mufassal-den sonuçlanmak-ebilmek bulunmak içinde Hara vd. 3 ve Nachbar vd. 4.
Burada kullanılacak ACE yöntemi üzerinde bizim daha önce yayımlanmış eserler6temel alır. Ancak, protein örnek için EOF işaret acetanilide eklenmesi uygun değildir. AtHIRD11 geniş tepe desen gösterir ve örnek için EOF marker ekleme iki doruklarına gizlemek. Bu nedenle, işaretçiyi ayrı bir vadede kullanılır. Bağlama davranışı inceledi önce önceki deneyler sırasında bulunan tepeler farklı conformers olduğunu doğruladı. Bu nedenle CGE protein conformers arasında ayırt etmek için kullanılır, translasyon protein ve onların farklı kitleler tarafından AtHIRD11, parçaları gibi yabancı maddelerin değiştirilme tarihi. Daha sonra çeşitli farklı metal iyonları karşı karakterize AtHIRD11 örneği’nın bağlama davranış araştırıldı.
Bu makalenin amacı, farklı conformers bağlama davranış farklılıkları değerlendirmek için bir IDP ve diğer bileşenleri örneği arasında ayırt etmek için deneysel bir kurulum tarif etmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm CE deneyler için kılcal hazırlanması kritik bir adımdır. O küçük çaplı bir cam tüp olduğundan, onu kolayca ele alınması nerede kaplama kaldırılır spotları kırabilir. Kılcal yüklemesine araç çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
ACE yöntemi esas olarak kullanmakla ilgili önemli adımlar için deneysel Kur ilgilidir. Başka bir önemli adım doğru örnek ekleme parametreleri bulgudur. Örnek enjekte miktarı yüksek tepeler için yeterli olmalı. Ancak, bu a?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz minnettar Masakuza Hara (Araştırma Enstitüsü yeşil bilim ve teknoloji, üniversite Shizuoka, Japonya) AtHIRD11 protein örnekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
