CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için
Summary
Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.
Abstract
Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.
Introduction
Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş1yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırakılır. Büyüme parazit RBCs içinde sıtma2ile ilişkili klinik belirtiler doğrudan sorumlu.
Yakın zamana kadar transgenik P. falciparum üretim zahmetli bir süreç, birkaç tur birçok ay sürdü ve yüksek başarısızlık oranı olan ilaç seçimi içeren oldu. Bu zaman alan yordamı relieson rasgele DNA nesil bölgenin ilgi ve parazit endojen yeteneğine rağmen genomunu onarmaya tatili homolog onarım3,4,5,6 . Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli olarak Interspaced palindromik tekrar/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom düzenleme başarıyla P. falciparum7,8‘ kullanılmıştır. Bu yeni teknoloji sıtma araştırma giriş yapılmış bu ölümcül Plasmodium parazitler biyoloji anlayış ilerleyen için kritik. CRISPR/Cas9 Kılavuzu RNA’ların (gRNAs) faiz gen için homolog genlerin özel hedefleme için sağlar. GRNA/Cas9 karmaşık gen gRNA yoluyla tanır ve Cas9 sonra tamir mekanizmaları organizma9,10inisiyasyon zorlama iki iplikçikli mola tanıtır. P. falciparum homolog olmayan son katılma yoluyla DNA sonları onarmak için makine eksik olduğundan, Homolog rekombinasyon mekanizmaları kullanır ve Cas9/gRNA-indüklenen onarmak için transfected homolog DNA şablonları entegre iki iplikçikli ara11,12.
Burada, bir protokol P. falciparum koşullu devirme mutantların üretimi için CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak mevcut. Protokol glmS ribozyme PfHsp70x koşullu olarak devirme protein düzeyleri için kullanımı gösterilmiştir (PF3D7_0831700), bir koruyucuya ihraç P. falciparum tarafından ev sahibi RBCs13,14. GlmS ribozyme (ki glucosamine-6-fosfat hücrelerdeki dönüştürülür) glucosamine ile tedavi tarafından protein14bir azalma önde gelen onun ilişkili mRNA ayırmak için etkinleştirilir. Bu iletişim kuralı kolayca istikrarsızlık etki alanları veya RNA aptamers4,5,15gibi diğer koşullu devirme araçlarını kullanmak için adapte edilebilir. Bizim iletişim kuralı dizileri tarafından çevrili sıra kodlama hemagglutinin (HA) etiketi ve glmS ribozyme oluşan bir onarım plazmid nesil bu PfHsp70x açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3′ UTR homolog ayrıntılardır. Ayrıca gRNA sürücü ifade için ikinci bir plazmid nesil açıklar. Bir ifade Cas9, sürücüler üçüncü ile birlikte bu iki plazmit RBCs transfected ve P. falciparum parazitler genom değiştirmek için kullanılır. Son olarak, biz bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarif-entegrasyon-in etiket ve glmS ribozyme doğrulamak için teknik dayalı. Bu son derece uyarlanabilir ve/veya sıtma parazit biyoloji yeni görüşler üretmek için bizim yetenek geliştirme herhangi bir P. falciparum genlerin tam nakavt için iletişim kuralıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA –glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O’Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
