عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة
Summary
وسيمكن هذا البروتوكول للقراء بنجاح إنشاء نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق وبعد ذلك عزل والثقافة المعوية الخلايا الجذعية لدراسة إصلاح الظهارية بعد إصابة.
Abstract
ويظل الاسكيمية المعوية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في المرضى البشرية والبيطرية. تؤدي العديد من الأمراض العمليات في الاسكيمية المعوية، عندما انخفضت إمدادات الدم، وبالتالي الأكسجين للامعاء. هذا يؤدي إلى فقدان جدار الأمعاء والأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. تتواجد في قاعدة الخبايا Lieberkühn الخلايا الجذعية المعوية وهي المسؤولة عن تجديد المعوية خلال التوازن والإصابات التالية. وأتاحت دراسة التفاعلات بين الخلايا الجذعية الظهارية ناجحة السابقين فيفو تقنيات استزراع خلية بوضع شروط الثقافة التي تدعم نمو النظم مثل جهاز الظهارية ثلاثي الأبعاد (يسمى “انتيرويدس” و ” كولونويدس “من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي). هذه انتيرويدس مكونة من سرداب ومجالات مثل زغابة وناضجة لاحتواء كافة أنواع الخلايا وجدت داخل الظهارة. تاريخيا، استخدمت نماذج مورين لدراسة الإصابة المعوية. ومع ذلك، يقدم نموذجا الخنزير العديد من المزايا بما في ذلك تشابه الحجم فضلا عن تشريح الجهاز الهضمي وعلم وظائف الأعضاء للبشر. باستخدام نموذج الخنزير، يمكننا وضع بروتوكول التي قطعي حلقات من الأمعاء الاسكيمية يمكن أن تنشأ داخل حيوان مفردة، وتمكن الدراسة من اختلاف الوقت النقاط من الإصابات الدماغية وإصلاح فيفو. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف طريقة لعزل والثقافة أن الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية من الأمعاء، مما يسمح لمواصلة دراسة إصلاح الظهارية، عن طريق الخلايا الجذعية، والتضمين السابقين فيفو.
Introduction
الإصابات الدماغية المعوية، ونتيجة لتوافر الأوكسجين انخفض بسبب تخفيض أو انسداد كامل لتدفق الدم إلى الأمعاء، ما زالت سببا هاما للمراضة والوفيات في المرضى الإنسان والحيوان1،2. الأضرار الدماغية، جنبا إلى جنب مع التهاب لاحقة وتسلل الخلوية، يؤدي إلى حل وسط الحاجز المخاطي. أن الحاجز المخاطي أمر حاسم لمنع إزفاء البكتيرية والسموم المرتبطة بها إلى الدوران الجهازي3،4. يمكن أن يؤدي تشكيل إلحاق الضرر بالأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم إصابة5ضخه اللاحقة من الأنسجة الدماغية. منذ الاسكيمية المعوية نادراً ما يمكن الوقاية منها، معظم الأبحاث الحالية تركز على النهوض بتقنيات الكشف المبكر عن الاسكيمية وتطوير رواية النهج العلاجية التي تقلل من ضخه الإصابة أو هدف إصلاح الغشاء المخاطي.
نماذج حيوانية قد استخدمت على نطاق واسع لتوسيع معرفتنا العلوم الأساسية من الإصابة ضخه الاسكيمية، وتظل الحتمية للبحوث متعدية الجنسيات. وكانت نماذج القوارض الأكثر استخداماً نظراً لقدرتها على أن تكون محوره وراثيا6. في الآونة الأخيرة بيد استخدام نماذج حيوانية كبيرة، على وجه التحديد الخنزير، قد دعت للدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل نظراً لوجود عدد من المزايا بما في ذلك أوجه التشابه الخنازير التشريحية والفسيولوجية للبشر7،8. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الضرر لدراسة الإصابة الاسكيمية-ضخه وتشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، الاسكيمية التدفق المنخفض وانسداد الأوعية الدموية المساريقي العلوي القطاعي. استعراضاً كاملا لهذه النماذج هو خارج نطاق هذه المقالة المباشر الكتاب القراء إلى مراجعة الأخيرة3.
ويتيح الاستخدام السابقين فيفو نظم الثقافة الخلوية بالإضافة إلى نماذج في فيفو ، أداة واعدة لدراسة التوازن المعوية وإصلاح بعد الإصابة. الأمعاء والخلايا الجذعية المسؤولة عن انتشار الهاتف الخلوي ودوران البطانة الظهارية المعوية. عندما معزولة من الأمعاء العادية أو الجرحى، الخلايا الجذعية المعوية يمكن الحفاظ على الثقافة، وتخدم كأداة أو نموذج لدراسة الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا الظهارية. طرق عزل وإقامة هذه ثلاثية الأبعاد الثقافة نظم (يطلق عليها انتيرويدس وكولونويدس عند المستمدة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي) وقد وصف لمجموعة متنوعة من الجهاز وأنواع نظم9،10 11، ،،من1213. على وجه التحديد، داخل الجهاز الهضمي، استخدمت هذه النظم الثقافة إلى أمراض معوية نموذجية بما في ذلك السرطان والإصابة بمسببات الأمراض و مرض التهاب الأمعاء14. وفي هذا الوقت، لا توجد تقارير تصف بالعزلة والحفاظ على الخلايا الجذعية المعوية من إيشيميكالي إصابة الأمعاء الدقيقة في أي من الأنواع. ولذلك، نحن هنا وصف عملية الاسكيمية المعوية في الرواية كبير حيوان الخنزير نموذج، مما يسفر عن إصابة استنساخه والقدرة على عزل الخلايا الجذعية المعوية من الأمعاء العادية والمصابين إيشيميكالي لدراسة إضافية استرداد السابقين فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطوير نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق ويتوسع نماذج مورين السابقة عن طريق السماح لدراسة نقاط زمنية متعددة من إصابة الأنسجة داخل الحيوان نفسه. وهناك عدة نقاط المناقشة الحاسمة لهذا البروتوكول بما في ذلك ربط السفن السليم وضخه الأنسجة وسرداب نجاح زراعة الخلايا.
ربط السفن السليم أمر ضروري لإيجاد نموذج الاسكيمية كاملة. إذا كانت مرتبطة الخياطة موزعة أو المشبك تشديد تماما، لا الدم من الشريان السميكة قد يستمر لإدخال الأنسجة ولا يمكن الخروج منه بسبب انهيار الوريد رقيقة الجدران. ينتج عن هذا التسرب دم إلى بروبريا الصفيحة يسبب تلف الأنسجة الإضافية. ومع ذلك، تبعاً لنوع الإصابة الدماغية قيد الدراسة، قد رغبت في الاسكيمية كاملة أو نزفية. على سبيل المثال، عملية زرع الأمعاء، يفصل الأمعاء تماما من إمدادات الأوعية الدموية (الشريان والوريد) أثناء مرحلة الاستئصال الداخلي، الذي ينتج الاسكيمية المعوية كاملة. بدلاً من ذلك، ومع ذلك، عندما هو الملتوية في مساريق أثناء حدث مثل انفتال الأمعاء، عودة وريدي هو غالباً ما أعاقت أولاً، المؤدية إلى الدم إضافية داخل الأنسجة قبل أن الإمداد الشرياني إعاقة، وبالتالي خلق الاسكيمية النزفية.
الإصابات الدماغية ينتج عن تلف الأنسجة بدءاً من طرف زغابة وتوسيع وصولاً إلى القاعدة من سرداب3. خلال الاسكيمية، لا تزال تستخدم الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ويولد هيبوكسانثيني المستقلب. عندما يتم ريبيرفوسيد الأنسجة بالأكسجين، يصبح استقلاب طريق أوكسيديز زانتيني hypoxanthine وتنتج الجذور الحرة دسموتاز مما أدى إلى إصابة الغشاء المخاطي والجذب من نسيج إتلاف العَدلات17،18. أنواع الاختلافات في بنية الأوعية المخاطية فضلا عن التعبير متفاوتة من أوكسيديز زانتيني، يؤدي إلى درجات متفاوتة من الإصابة ضخه3. نماذج القطط والقوارض من الاسكيمية-الاكسجينيه أكثر عرضه للإصابة ضخه من الأكسجين التفاعلية والايضات19،20. وفي المقابل، تم العثور على الخنازير أقل أوكسيديز زانتيني، وذلك أقل الإصابة ضخه، مما يجعل هذا النموذج أكثر قابلية للمقارنة لأن الاسكيمية المعوية البشرية21. في هذا الوقت، استخدام نماذج الخنزير المعدلة وراثيا لدراسة الإصابة المعوية أو خروج المغلوب لا وصف، مما يجعل هذا قيداً رئيسيا لهذا النموذج. اختيار النموذج الحيوان السليم يعتمد على عملية المرض أو شرط محدد الباحث يرغب في الدراسة. على سبيل المثال، كانت نماذج الخنزير من الإصابات الدماغية تصل إلى 6 ح22من وصف، بينما هي الإجراءات الأكثر الدماغية في نماذج مورين23من 45-60 دقيقة.
يسمح عزل ناجحة من الخبايا المعوية من الأمعاء إيشيميكالي التالفة والعادي للدراسة لاسترداد الظهارية في الثقافة. هذا النظام يسمح للباحث أن يركز فريد ظهارة وحدها، كما أن هناك إمدادات لا الأوعية الدموية أو مكونات الخلايا المناعية للنظر. وهذا يتيح الفرصة لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية والانتعاش بعد الإصابة بالإضافة إلى الاستجابة لعوامل النمو المختلفة، أو العلاجات التي يديرها أثناء الجراحة أو عزل سرداب التالية المكمل لوسائط الإعلام الثقافة. وتظل هذه الخطوة الأكثر صعوبة، كما تتطلب عزل من الحلقات لحقت بها أضرار بالغة تهز لطيف والإزالة السريعة للحلول التي تحتوي على يدتا في حال الأقبية تصبح قبل الأوان فصلها. إذا كانت هذه الحلقات من الأمعاء لا تغسل جيدا، الأقبية قد يمكن أن تصبح ملوثة في الثقافة. نتيجة لذلك تمت إضافة حل مضاد حيوي فطري إلى كلا الحلول الدكتور بالإضافة إلى وسائط الإعلام إيسك. نقطة نقاش أخرى تركز على الأمعاء التي يتم جمعها كعنصر تحكم عادي. الأنسجة التحكم حتى “طبيعية” كما الحيوانات الخضوع للتخدير مع التعديلات الممكنة في نضح الأنسجة النظمية، جنبا إلى جنب مع إمكانية تعميم وسطاء التهابات ثانوية الاسكيمية، قد لا تمثل عنصر تحكم حقيقية. في هذه التجارب، أنها ملاحظة أنه يبدو أن الأنسجة مراقبة مماثلة صارخ والأشيع للأنسجة من الحيوانات التي لم تطرأ الاسكيمية في تجارب أخرى (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
وباختصار، يصف هذا الأسلوب نموذج استنساخه من الخنزير الاسكيمية المعوية، أن نماذج عن كثب ما يحدث في الإصابات الدماغية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يرد وصف لعزل الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية، الذي يعمل على دراسة إصلاح الظهارية واستجابة ممكنة للعلاج في الثقافة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا المشروع الدعم من K01OD0199 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة T32 OD011130، P30DK034987 المعاهد الوطنية للصحة، وقسم العلوم السريرية نشر الأموال
Materials
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. . Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. . Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
