Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

1. Coverslip 세척 및 살 균 15 mm (직경) 커버 유리 (1 호) 40 mL 37 %HCl 60 mL 100%의 혼합물을 포함 하는 500 mL 플라스 크에 담가 EtOH (이상의 100 coverslips 솔루션을 세척 하는 100 mL 당).참고: 갓 구입 하는 경우에 coverslips 청소 되어야 한다 엄격 하 게 그들의 표면에 세포를 뿌리기 전에. 이 때문에 그들은 거시적 표시 되지 않습니다 하지만 효율적으로 접착 및 적절 한 라이브 세포의 확산을 방해 수 있는 윤활제의 박막을 포함 될 수 있습니다. 반면 같은 영화는 산 이나 염기를 포함 하는 솔루션을 효율적으로 제거 될 수 있다 (참조 피셔 외. 13) 우리가 일상적으로 사용 하 여 위에서 설명한 산/알코올 혼합. 회전 통에 30 분 동안 커버 유리를 포함 하는 플라스 크를 흔들어. 자유롭게, swirled 하지만 자주 위반을 피하기 위해 충분히 천천히 커버 유리를 허용 하는 속도 선택 하십시오. 재사용 하는 경우 깨진된 유리 조각을 제거 하는 솔루션을 여과. 살 균 물 200 mL 이상 포함 하는 플라스 크를 커버 유리를 전송 하 고 산 성 냄새는 멸종 될 때까지 반복 해 서 물을 교체 하는 동안 회전 통에 품 어. 몇 시간 동안 여러 세척은 HCL EtOH 흔적의 완전 한 제거 하는 것이 좋습니다. 필터 종이에 개별 커버 유리를 건조. 10 cm (직경) 페 트리 접시의 하단에 커버 유리 필터 종이, 고 열으로 덮여 장소 건조 소독. 이 함께 커버 유리 하면 압력가 마로 소독을 하지 마십시오. 2. 셀, Transfection, 및 Coverslips에 뿌리기의 치료 B16-F1 마우스 흑색 종 세포에 따라 표준 셀 문화 DMEM (4.5 g/L 포도 당)에 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민, 그리고 1% 페니실린-37 ° C, 7% CO2에서 스 성장. DMEM (4.5 g/L 포도 당) 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 mM 나트륨 pyruvate, 1 x MEM 비필수 아미노산에 따라 표준 셀 문화 (37 ° C, 7% CO2에서 조직 문화 인큐베이터) microinjections에 대 한 NIH3T3 fibroblast 세포 성장 2 mM 글루타민, 및 1% 페니실린-스. Transfections, 3 cm (직경) 플라스틱 접시에 10 cm 요리와 1:5 비율로 통로에 100% 합류를 B16-F1 셀을 성장. 같은 날, B16-F1 셀 적어도 6 h에 대 한 준수 허용 되었다, 후 500 ng/photoactivatable PA-GFP-말라의 요리 또는 β-말라 EGFP 태그 플라스 미드 DNA transfect. MCherry 인코딩 벡터와 PA-GFP-말라의 공동 transfections, 3 cm 접시 당 플라스 미드 DNA의 1 µ g의 총을 섞는다. Transfection 시 약 (자료 테이블) B16-F1 셀 transfect 3 cm 요리 150 m NaCl 포함 500 m의 200 µ L를 섞어 DNA의 ng 150mm transfection 시 약의 1 µ L을 포함 하는 NaCl의 200 µ L로 구성 (즉, DNA (µ g): 시 (µ L) 비율 1: 2의 사용 되었다). 실 온 (RT)와 drop-wise 셀을 포함 하는 3 cm 접시에 피펫으로 20 분 transfection 혼합물을 품 어. 부드럽게 혼합 하 고 37 ° C, 7% CO2에서 밤새 품 어 접시를 소용돌이 친다. 50 mM Tris, pH 7.4와 150 m m NaCl 포함 된 laminin 코팅 버퍼를 준비 합니다. B16-F1 셀에 대 한 15 m m 커버 안경 laminin (laminin 코팅 버퍼에 25 µ g/mL)의 150 µ L를 확산 하 여 코트와 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 NIH3T3 세포 fibronectin 솔루션 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 25 µ g/mL)와 커버 안경 코트와 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 PBS, 커버 유리 laminin 또는 fibronectin incubated 세척 후 PBS를 발음 하 고 transfected 세포의 2 개 mL를 추가. Transfected B16-F1 셀 씨앗 (1시 30분에 confluent 접시에서 비율), transfection laminin 코팅 coverslips에 다음날에. NIH3T3 fibroblasts 씨앗 (1시 20분에 confluent 접시에서 비율) fibronectin 코팅 coverslips에. 현미경 검사 법 전에 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 하룻밤 laminin 또는 fibronectin 코팅 커버 유리에 확산에 셀 수 있습니다. 또한, 현미경 실험 세포는 적어도 2-3 h에 대 한 확산 수는 같은 날에 시작할 수 있습니다. 3입니다. 현미경 이미징 챔버의 조립 열 전도성 RC-26 알루미늄 챔버 (그림 1a) 현미경 이미징 사용 하 여. 주사기 (그림 1b)를 사용 하 여 플라스틱 마감재 개통의 컨투어 주위 실리콘 윤활제 얼룩. 그림 1(c) 상공에 셀 사이드 최대 커버 글라스를 놓습니다. 플라스틱 마감재는 coverslip와 챔버 사이 보안 씰을 커버 글라스 위에 놓습니다. (그림 1의d)를 유출 하는 매체를 피하기 위해 챔버에 슬라이딩 클램프를 조이는 여 (대각선)을 피하기 위해 coverslip 파손 플라스틱 마감재를 수정. 중앙 지역으로 피 펫 37 ° C 사전 온수 현미경 매체. Autofluorescence에 따라서 현미경 검사 법에 대 한 최적화 된 매체에 대 한 설명 위에 있지만 F12-햄 대신 DMEM, 또한 포함 된 20 mM HEPES CO2 (그림의 부재에 있는 세포의 배양과 문화 매체로 동일한 제조 법을 사용 1e). 열 검출기 챔버의 지정 된 슬롯에 삽입 하 고 37 ° C (그림 1f)의 일정 한 온도 유지 하는 TC 324B 자동 온도 조절기 챔버의 전극 연결. 목표에 침수 기름의 작은 방울을 배치 하 고 챔버 상단에 배치. 설치 하는 동안 온도에서 복구 하 고 현미경 매체에 적응할 수 있도록 적어도 10-30 분 동안 셀 챔버를 품 어. 현미경 검사 법을 시작 하기 전에 중간 구성 요소와 중간 증발 때문에 혈 청의 부적절 한 농도 피하기 위해 챔버 (약 800 µ L)의 중앙 저수지에서 문화 매체를 교체 합니다. 개방 챔버와 함께 장기간된 현미경 세션 증발 매체의 일상적인 변화 필요 합니다. 4. microinjection 절차 코트는 coverslips, 셀, 준비 하 고 위에서 설명한 대로 이미징 챔버를 조립. 녹여 주입을 순화 된 단백질의 약 수 (일반적으로 10 µ L 이하로) 적절 한 microinjection 버퍼와 희석.참고: 버퍼 구성 단백질 및 셀 형식에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 대부분 셀 PBS와 주입을 좋아하지 않아 하는 6.95 사이 8.00 pH를 사용 하 여 PBS를 사용 하지 않도록 알아서. Rac1 microinjection에 대 한 100 m m NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1mm DTT 포함 하는 버퍼를 준비 합니다. 마그네슘2 + 이온 작은 GTPase 안정성을 위해 필수적입니다.주: 단백질 농도 일반적으로 0.1-1 사이 다 mg/mL (최대 2 mg/mL), 단백질에 따라, 실험, 및 세포의 유형 유형. 해당 하는 경우 주사 하기 전에 바늘 흐름의 존재를 확인할 수 있습니다 하 고 실험 후 성공적인 주사의 설명서는 단백질 해결책에 형광 염료, 불활성 dextran (0.5 µ g/mL, 70 kDa) 등을 추가 합니다.참고: 여기에 실험 다음 주입된 Rac1의 역학을 직접 형광 단백질의 라벨에 따라 가능한 것만 겨냥 하지. 형광 염료 나 형광 단백질 융합 단백질의 결합은 가능 하지만 피할 여기 특히 가족 Rho GTPase Rac1 같은 작은 단백질의 신호 전달 기능 방해의 위험을 비호 (20 kDa). 바늘 microinjection 모 세관에 있는 경우를 막힘으로 이어질 수 있는 단백질 집계 제거 하려면 적어도 30 분 동안 10000 x g에 단백질 해결책을 원심. 유연한 피 펫 팁/microloader 팁을 사용 하 여 뒷면에서 주입 혼합물의 1 µ L 함께 microinjection 바늘 (모 세관 microinjection)를 로드 합니다. 공기 방울 바늘 팁에 있다면, 그들을 제거 하기 위해 부드럽게 바늘 기지를 누릅니다. 니 들 막힘을 일으킬 수 바늘 팁의 건조를 피하기 위해 빠르게 진행 합니다. 신중 하 게 조정 하는 micromanipulation 장치에 바늘 홀더. 위상 대비 영상, 바늘 선적의 앞에 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 확인 하는 경우 현미경 콘덴서를 방해 하지 않고 바늘을 위아래로 이동 충분 한 공간이 있다. 바늘 홀더에 microcapillary를 속이 고, 시 세포 배양 매체에 바늘 끝을 translocating 전에 microinjection 압력 장치를 사용 하 여 바늘에 압력 (20-50 hPa 배경 압력) 적용 됩니다.참고: 때 바늘은 매체에 압력을 활성화 것 이다 매체 모 세관 힘에 의해 빨려 고 따라서 관심의 솔루션의 주입을 금지. (낮은 배율 목표를 사용 하 여 촉진) 보기의 필드에 바늘을 위치. Microinjection 실험에 대 한 40 X 건조 목표는 여기 사용 되었다. 거시적 수직 위치에서 가운데를 기준으로 목표 렌즈의 (이 가속화 될 것으로 바늘 끝을 찾는) 바늘 팁을 배치 합니다. 단계 대조 광학 현미경을 사용 하 여 보기의 필드, 광학 평면에 상대적인 수평 평면에 바늘 팁 잘-셀 레이어 위에 이동.참고: 바늘은 처음 보기의 필드에 그림자로 나타나고 포커스 면 다음 팁을 시각화 하기 위해 조정 될 수 있다. 바늘의 팁 발견 되 면 점차적으로 광학 평면 뒤에 셀 레이어 가까운 위치까지 바늘 팁 낮은. 형광 dextran을 사용 하 여 형광 채널을 전환 하 여 바늘 흐름을 확인 하 고 지속적인 “배경” 흐름을 얻기 위해 압력 장치를 사용 하 여 흐름을 조정.참고:이 문서에서 설명 셀을 터치를 통해 플라즈마 멤브레인을 통해 침입 하 여 중재 수동 주입, 표면 및 지속적인 바늘 흐름 중 바늘 팁의 움직임. 이 더 높은 셀 숫자 나중 세포 인구로의 주입에 대 한 적절 한 주입 이벤트 기간 동안 프로그램된 바늘 바늘을 낮추고 압력 증가 함께 자동 주입 장치에서 고유 해야 합니다. 분석입니다. 여기 설명 하는 방법은 하기 전에, 도중, 그리고 후에 microinjection 시간 경과 현미경 검사 법에 의해 단일 세포 분석을 위해 최적화 되어 있습니다. 관심의 셀 찾기 및 점차적으로 셀 위에 바늘. 때 microinject 준비, 낮은 초점에서 세포를 유지 하면서 micromanipulator 조이스틱의 정밀한 피니언을 사용 하 여 셀 perinuclear 지역으로 점차적으로 바늘. Microinjection, 셀, 침투 또는 현미경 설치에 매우 부드러운 탭 과도 막 파열 원조 충분 할지도 모른다 세포의 원형질 막에 터치 부드럽게 합니다.참고: 바늘 끝에 흰 점이 원형질 막;와 접촉 시간이 표시 됩니다. 막 파열, 다음 바늘 팁은 다시 봉인, 셀에 주입 솔루션의 부드러운 흐름을 동반. 셀에 표시 되 자 마자 주입 프로세스를 중지 (0.3 이내 s) 매체에 바늘 끝을 이동 하 여. 형광 dextran을 사용 하 여, 성공적인 주사 형광에 의해 즉시 문서화 될 수 있다. 원하는 경우 시간 경과 이미지 수집 전이나 후에 microinjection를 시작 합니다.참고: 약물 이나 억제제의 로컬 응용 프로그램 실행할 수 있습니다, 여기에 모든 단계에서 제외 하 고는 microinjection 이벤트 당. 로컬 응용 프로그램에 대 한 활성 분자의 확산 유량 압력에 의해 제어 되 고 형광, 문서화 될 수 고 바늘 팁 원하는 높이에 배치 될 수 있습니다. 로컬 응용 프로그램의 참조 하십시오 예를 들어, Rottner 및14 또는 Kaverina 외. 15 Microinjection에 따라 단백질의 효과 발생 될 때까지 기다립니다. 다른 단백질 및 예상된 결과 따라 보육 시간 달라질 수 있습니다. 작은 GTPase Rac1 lamellipodium 형성의 응답 수 1 분 이내 시작 또는 더 적은, 하지만 완벽 하 게 (그림 1g, h)를 개발 하는 것을 평균 약 10-15 분 걸립니다. 판사는 microinjection 다음 세포의 생존 능력.참고: 부적절 하거나 유해한 주사 자주 동반 하는 비 특정 셀 지 철회 또는 원형질 막 파열 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 평면 세포 지역에서 주사에 대 한 발생할 수 있는 위쪽 및 아래쪽 플라즈마 멤브레인 통해 파고 하지 마십시오.참고: 사출 볼륨은 최소한으로 유지 되어야 한다 (이상적으로 2 mg/mL 자주 바늘 막힘으로 인해 허무 하 게 될 수 있습니다. 그러나,이 또한 품질과; 순화 된 단백질의 동작에 따라 다릅니다. 예를 들어, 걸 붙일 결합의 주입 농도 의존 하 고 피할 수 없는 합 바늘 팁에 의해 복잡 하 게 하 고 그래서 그것 드물게 오늘 실행 됩니다 (참조 작은 외. 16)입니다. 전에, 동안, 나는 microinjection의 효과 후, FRAP 또는 photoactivation에서 수행할 수 있습니다 같은 셀 (섹션 5 및 6 참조). 5. 졸라 절차 Transfect 세포 유형의 관심 (B16-F1 셀에 여기) 플라스 미드 DNA 관심 붙일 태그가 단백질 인코딩 (여기, β-말라의 EGFP 태그 버전 사용 되었다). 시드 laminin 코팅 coverslips (단계 2.10)에 셀입니다. 조립 영상 실 (제 3). 다음 설정을 사용 하 여 lamellipodial 지역 photobleaching에 대 한: 65 mW 레이저 전원 (실험 설치 및 레이저 소스에 따라 변수); 10 픽셀 레이저 빔 직경; 1 ms 표 백제 망설임 시간/픽셀; 500 GFP 노출 시간; 1, 500 밀리초 시간 간격입니다. 이 논문에서 실험 결과 100 X 1.4NA apochromatic 목표와 수행 했다. Photobleached 지역의 치수에 정확성을 보장 하기 위해 레이저 캘리브레이션을 수행 합니다. 교정, 이전 어떤 셀/형광 신호를 부족 한 영역을 보기의 필드를 이동 하 고 디스플레이에 그림을 관찰 합니다. 객관적인 확대 각각 확대 버튼을 클릭 하 여 선택 하 고에서 레이저 전력 (3-5 mW)를 줄일 수는 “패널 | 강도”메뉴입니다. Visiview 소프트웨어 (v2.1.4)에 수동 보정을 시작 하려면 선택 합니다 있는 “구성 | FRAP”메뉴를 클릭 합니다 있는” 보정 | 수동 조정”메뉴입니다. 레이저는 날카로운 점으로 구별 될 수 있다 확인 하십시오. 만약에 아닙니다, 촛점 하거나 레이저 하드웨어를 조정 합니다. 수동으로 미리 결정된 소프트웨어 X Y 좌표에는 레이저를 안내 하 여 보정을 수행 합니다. 이 소프트웨어 특히 현재 배율에 대 한 사용자 정의 영역에 레이저를 표적 하는 방법을 지시 합니다. 레이저를 트리거링 하기 전에 GFP로 전환 하 고 이미지/시간 경과 수집을 시작 합니다. 수동으로 영역에 디스플레이 보면서 GFP 채널에 photobleached 됩니다 그립니다. 적어도 3-4 프레임 이미지 수집의 개시 후 405 nm 레이저의 수동 방 아 쇠에 의해 photobleaching을 시작 합니다. Photobleaching 이전 프레임을 획득 하는 것이 나중에 데이터 분석에 이미지의 필요 합니다. 6. Photoactivation 절차 참고: 소프트웨어, 현미경 설치 및 설정, 레이저 파워 제외한 비슷합니다 FRAP에 대 한. Photoactivation, FRAP, 비교는 중요 한 차이점에에서는 photobleaching, 동시에 photobleaching 없이 PA-GFP를 활성화를 사용 해야 합니다에 대 한 고용 405nm 레이저 전력 보다 크게 낮은 그것. 공동 transfect 세포 유형의 관심 (B16-F1 여기 세포; 단계 2.5 참조) 플라스 미드 DNA와 인코딩 PA-GFP-말라와 다른 붙일 표시 된 단백질 (예: mCherry 또는 mCherry-Lifeact).참고: 대부분의 경우, mCherry-긍정적인 세포도 됩니다 PA-GFP-말라 벡터, photoactivation 이전 GFP 채널에서 볼 일반적으로 후자에 대 한 긍정적인. MCherry-긍정적인 세포는 또한 PA GFP에 대 한 긍정적인 기회를 강화 하려면 mCherry:PA의 1:2 transfection 비율-GFP-말라. 이 프로토콜, mCherry을 표현 하는 세포의 90% 이상 PA-GFP-걸의 성공적인 활성화 표시. 시드 B16-F1 셀 laminin 코팅 coverslips (단계 2.10)에. 조립 영상 실 (제 3). Photoactivation 실험을 시작 하기 전에 필요한 경우, 선택 된 목표 (5.4-5.6 단계)에 대 한 레이저 캘리브레이션을 수행 합니다. GFP/488 nm 이미지 수집 (실험 설계)에 따라 500 ms 노출 및 1, 500 밀리초 시간 간격을 설정 합니다. 듀얼-채널 또는 3 채널 시간 경과 영화 “파장 시리즈” 사각형을 표시 하 고 채널에서 원하는 수를 선택 하 여 인수에 대 한 소프트웨어 설정을 조정는 “취득 | 파장”메뉴입니다. 시간 경과 영화 위상 대조와 GFP 채널 인수 하는 것이 좋습니다. 선택적으로, 또한 포함 mCherry 채널; 그러나, 너무 많은 빛으로 세포를 노출 photodamage를 유도 수 있습니다. 이것은 Oxyrase17, 등 산소 청소부와 효과적인 치료 셀 챔버 씰링을 필요로 하지만 피할 수 있었다. MCherry 채널에서 transfected 세포를 찾아. 레이저를 실행 하기 전에 이미지/시간 경과 수집을 시작 하 고 수동으로 디스플레이 보면서 단계 대비 채널에 photoactivated 수 영역을 그립니다. Photoactivation 405 nm 레이저의 수동 트리거에 의해 시작 (강도 설정에서 5 ~ 15 mW 사이 “패널 | 강도”메뉴) 이미지 수집 개시 후 최소한 3-4 프레임. 7. 데이터 분석 및 FRAP 결과의 프레 젠 테이 션 참고: 제시 메서드는 VASP는 접착 사이트와 lamellipodia를 돌기의 끝이이 경우에 동적 말라 어셈블리의 사이트에 축적 하는 단백질의 매출 조사를 위해 사용 됩니다. 우리는 lamellipodium 끝에 그것의 회전율 분석 하지만 VASP 또는 다른 단백질 및 다른 subcellular 구획의 회전율을 조사 분석의 동일한 원리를 적용할 수 있습니다. 오픈 시간 경과 영화에서에서 파생 된 Visiview Metamorph 소프트웨어에. 이 문서에서는, Metamorph v7.8.10 사용 되었다. 수동으로 Metamorph 각각 영역을 표시 하 여 photobleached 지역에 대 한 강도 값을 파생 합니다. Photobleached 면적의 일부 또는 전체를 커버 하 고 프레임에 그것의 위치를 수동으로 조정 하는 lamellipodium의 끝에 모양에서 (즉, 가장자리 돌출 하는 경우), 필요한 경우의 lamellipodial 농도 변경 내용을 추적 하기 위해서는 그리기 팁 변위 중 해당 구성 요소입니다. 배경 및 photobleaching 수집의 교정, 지역 내부 및 외부 셀을 분석 합니다. 그림 2는 측정된 농도의 대표 지역에 대 한 참조 하십시오. 동안 ROI 선택 메뉴를 사용 하 여 Metamorph에 그것의 강도 값을 추출 “측정 | 지역 측량 “입니다. “구성” 메뉴에서 “경과 시간” 및 “평균 강도” 옵션이 선택 되어 확인 하십시오. “로그 열기”를 클릭 하 고 “동적 데이터 교환”을 선택 합니다. 열고 Excel 스프레드 시트를 Excel에 붙여 Metamorph 값을 다시 “로그 열기” 버튼을 클릭 “OK”를 클릭 합니다.참고: 이러한 값은 형광 복구 곡선을 생성 하는 데 사용 됩니다. Photobleached 지역 (photobleaching 전에 지역 강도를 정규화)의 lamellipodium 끝에 형광 복구 곡선 생성, 다음 식을 적용 됩니다.   공식 1어디: 졸라Tn 은 다음 photobleaching; 관심의 각 프레임에 대 한 photobleached 지역 강도 테네시 밖으로 photobleaching; 다음 관심의 각 프레임에 대 한 셀 (배경) 외부 촬영 지역 강도 기능테네시 는 photobleaching (시간이 지남에 수집 photobleaching에 대 한 정상화 하는 데 사용); 다음의 각 프레임에 대 한 지역 농도 안에 평균 2 FRAPT-1 photobleaching; 전에 photobleached 지역 강도 T-1 이다 photobleaching; 하기 전에 셀 (배경) 외부 촬영 지역 강도 그리고 기능T-1 photobleaching 전에 관심의 각 프레임에 대 한 지역 농도 안에 평균 2. 관심의 각 시간 프레임에 대 한 조사를 모든 시간 프레임을 포함 하는 형광 복구 커브를 공식 1 을 사용 합니다. 시간의 길이 엄격 하 게 조사 단백질에 의존 합니다. 때 알 수 없는, 단백질의 이직 률을 얻으려고 예비 실험을 수행 합니다. 복구의 하프 타임을 계산, 시그마 플롯 (12 절), 형광 복구 곡선에는 해당 시간 (초)의 값을 붙여 및 수행을 사용 하 여 적합 한 곡선에서 “동적 맞는 마법사 | 최대 지 수 상승”도구입니다. 모노 지 수 선택 (단일, 매개 변수 3) 또는 (더블, 매개 변수 4) bi 지 수에 맞는 최고의 곡선 따라 기능. 모노 지 수 함수에 대 한 다음 수식을 사용 하 여:   공식 2 이중 지 수 함수에 대 한 다음 수식을 사용 하 여:   식 3 매개 변수 “b”와 “d” 복구의 하프 타임을 계산 하기 위해 Excel로 시그마 플롯공식 2 ( 식 3)에서 파생 된 붙여 넣습니다. 다음 방정식을 적용:   방정식 4또는   방정식 5 모노 지 수 함수 결과 맞는 정확한 곡선, 방정식 4만 적용. 모노 지 수 함수에 맞게 좋은 곡선 귀착되 지 않는다, 식 4 와 방정식 5모두 해결 하 여 bi 지 수 수식을 적용. 결과 두 반으로 대표 하는 두 개의 서로 다른 단백질 분수 회복의 시간을 고려:는 급속 하 게 그리고 천천히 교환 분수, 각각. 8. 졸라 Lamellipodial 걸 중 합 속도 의해 결정 Lamellipodial 걸 중 합 속도 결정, transfect EGFP 태그 β-말라, B16-F1 셀 photobleach lamellipodial 지역 (단계 5.9) 1.5 s 시간 간격 및 500 ms GFP 노출 사용 하 고. Metamorph에서 Visiview에서 취득 시간 경과 영화 열고 사용 목적에 따라 픽셀 / µ m 비율 보정은 “측정 | 거리 보정”도구입니다. 시간 경과 영화를 재생 하 고 선으로 얇은 판자 쪽으로 거꾸로 흐르는, lamellipodial 형광 복구는 얇은 판자에 도달 했습니다 때 후방 흐름을 추적할 수 있습니다 더 이상 프레임에 중지. µ M는 lamellipodium의 팁과 복구 된 형광의 뒤에 거리를 측정 합니다. 이 거리는 역행 흐름 및 돌출 거리의 합에 해당합니다. 또는 역행 흐름에서 돌출을 구분 하는 photobleaching 전에 선 한 프레임 lamellipodial 팁을 표시 합니다. 사용 기준으로 선 포인트 프레임 photobleaching; 시 lamellipodium 팁의 원래 위치를 참조 하 참조점 돌출 거리와 역행 흐름을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 시간 (초) 형광 복구 photobleaching 후 발생 하는 데 필요한 note 시간 또는 프레임 속도에서 수동으로 계산 수 있습니다 통해 Metamorph에 의해 시각화는 “측정 | 지역 측정”도구입니다. (8.4-8.6 단계에서 Metamorph 측정에 따라 일부 방정식 매개 변수)와 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 걸 중 합 속도 파생:   공식 6어디 걸 중 합 속도가 µ m/분에서, 역행 흐름 거리 µ m에는, lamellipodial 돌출 거리는 µ m, 이며 시간 초. 9. 단백질 보급 및 Photoactivation에 따라 이동성 분석 참고: 여기에 제시 된 방법을 시각화와는 cytosol 통해 단백질 보급의 정량화에 의해 볼 수 있듯이 PA-GFP를 융합 하는 걸의 photoactivation를 채용 하 여 말라 단위체 이동성의 분석을 설명 합니다. Lamellipodial 지역 내의 축적 뿐 아니라 cytosolic 영역에서 photoactivatable 걸의 보급을 측정를 사용 하 여 Metamorph 지역은 시간이 지남에 강도 결정 ( 그림 3는 ): cytosolic photoactivated 지역 (PA); lamellipodial 지역, 어떤 photoactivated에 단백질 (Lam); 시간이 지남에 축적 하는 것으로 예상 된다 (밖으로) 배경 형광의 정규화에 사용 되는 셀 외부 지역. 말라는 cytosol 내에서 이동성을 결정할 때 (참조 그림 3는, 지역 R1-R5) 별개의 cytosolic 영역을 측정 합니다. 참고 photobleaching 수집 활성화 시 초점-그리고 결국 세포 형광 증가로 인해 비슷한 방식 FRAP,으로 확인할 수 없습니다. 모든 지역에 대 한 강도 값에서에서 전송 Metamorph를 Excel 스프레드시트에 단계 7.4에에서 설명 된 대로. Photoactivatable 걸 photoactivation의 cytosolic 영역 또는 lamellipodial 지역 (둘 다 시 0% 강도의 cytosolic photoactivated 지역으로 표현 하는) 내에서 법인의 그것의 속도의 변위 속도 검사 단계 9.3 데이터에서 형광 커브를 생성. 다음 방정식을 적용:   공식 7   공식 8어디: PA테네시 cytosolic photoactivated 지역의 photoactivation; 다음의 각 프레임에 대 한 강도 램테네시 는 lamellipodial 지역의 photoactivation; 다음의 각 프레임에 대 한 강도 테네시 밖으로 photoactivation; 다음 셀 (배경)의 각 프레임에 대 한 외부 촬영 영역의 강도 PAT-1 photoactivation; 전에 cytosolic photoactivated 영역의 강도 램T-1 photoactivation; 전에 lamellipodial 지역의 강도 T-1 지역 photoactivation; 하기 전에 셀 (배경) 외부 촬영의 강도가 이다 PAT0 는 cytosolic photoactivated 영역의 강도 시 0 (즉, 첫 번째 프레임 photoactivation 후에); 그리고t 0 0 (즉, photoactivation 후 첫 번째 프레임) 시 셀 (배경) 외부 촬영 영역의 강도 이다. 필요한 경우 데이터의 더 나은 시각화에 대 한 각 후속 프레임에서 photoactivation 후 첫 번째 프레임의 강도 빼서 0 강도 곡선 정상화.참고: 다음 분석 방법 (단계 9.6-9.8) 또한 photoactivated 걸 내는 cytosol의 cytosolic 분산을 계산할 수 있습니다. 연속적으로 활성화 지역에서 distally 위치 cytosolic 영역에 대 한 농도 측정 합니다. 시간 0에 % 강도의 photoactivated 지역으로이 지역의 농도 나타내는 방정식 8, lamellipodial 농도 각 cytosolic 투자 수익에 대 한 강렬으로 대체 됩니다 어디를 적용 합니다. 크기와 개수는 지역 측정 셀 크기와 분산 거리에 따라 달라질 수 있습니다. Photoactivated 단백질 각 cytosolic 영역 침투의 속도 대 한 가능한 값을 파생, 시그마 플롯 (섹션 7에서 FRAP 분석 비슷합니다) 시간 및 각 지역에 대 한 형광 강도 증가의 곡선의 값을 붙여, 를 사용 하 여 방정식 2 및 파생 고원에 도달 형광 강도의 하프 타임 식 4 . 다른 실험적인 그룹 간의 t1/2 값을 비교 합니다.