Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade
Summary
Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.
Abstract
Tardigrades sont des animaux microscopiques qui entrent dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose face à la dessiccation et peuvent revenir à leur état d’origine lorsque l’eau est fournie. Le séquençage génomique des animaux microscopiques tels que la contamination bactérienne de risques tardigrades qui conduit parfois à des interprétations erronées, par exemple, au sujet de l’étendue du transfert horizontal de gènes chez ces animaux. Ici, nous fournissons une méthode d’entrée ultra basse pour séquencer le génome du tardigrade, Hypsibius dujardini, un seul spécimen. En employant l’exclusion de lavage et contaminant rigoureuse avec une extraction efficace de 50 ~ 200 pg d’ADN génomique d’un seul individu, nous avons construit une bibliothèque séquencée avec un instrument de séquençage de l’ADN. Ces bibliothèques ont été hautement reproductible et impartiale, et une analyse informatique des lectures séquencés avec autres génomes H. dujardini a montré une quantité minime de contamination. Cette méthode peut être appliquée à des tardigrades impossibles qui ne pourraient pas être séquencés à l’aide des méthodes précédentes.
Introduction
Tardigrades sont des animaux microscopiques peuvent entrer dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose, face à la dessiccation. Ils récupèrent de l’absorption de l’eau1,2. Dans l’état d’ametábolos, les tardigrades sont capables de tolérer des divers environnements extrêmes, incluent des températures extrêmes pressions et3 4,5, une dose élevée de lumière ultraviolette6, rayons x et rayons gamma 7 , 8et9de l’espace cosmique. Données génomiques sont un fondement indispensable pour l’étude des mécanismes moléculaires d’anhydrobiose.
Les tentatives précédentes pour séquencer le génome de tardigrades ont montré des signes de contamination bactérienne10,11,12,13,14. Séquençage génomique de ces petits organismes nécessite un grand nombre d’animaux et est sujets à une contamination bactérienne ; donc, nous avons déjà établi un protocole de séquençage en utilisant une méthode de saisie ultra basse à partir d’un seul spécimen de tardigrade, pour minimiser les risques de contaminations15. En utilisant ces données, nous avons effectué davantage une renumérotation de haute qualité et le remontage du génome de H. dujardini16,17. Ici, nous décrivons en détail cette méthode de séquençage génomique d’un seul individu tardigrade ()Figure 1). La validation de cette méthode de séquençage est au-delà de l’objectif de ce document et a déjà été abondamment discutée dans notre précédent rapport16.
Cette méthode se compose de deux parties : l’isolement d’un tardigrade unique avec le plus bas possible de la contamination et l’extraction de la qualité des niveaux du pictogramme de l’ADN. Le tardigrade est affamé et rincée avec l’eau, mais aussi des antibiotiques et observé au microscope avec un grossissement de X 500 à garantir l’élimination de toute contamination bactérienne. Les mesures et les estimations précédentes montrent qu’un seul individu de tardigrade contienne environ 50-200 pg de génomique DNA16, qui en est extraite par craquage de l’exosquelette de chitine par cycles de gel-dégel ou par homogénéisation manuelle. Cet ADN génomique est soumis à la construction de la bibliothèque et séquencé sur un instrument de séquençage de l’ADN. Une analyse informatique supplémentaire montre séquençage de haute qualité, mais aussi de faibles niveaux de contamination par rapport aux précédents projets de séquençage tardigrade.
Protocol
Representative Results
Discussion
La contamination bactérienne constitue une menace pour le séquençage génomique des organismes microscopiques. Alors que des études antérieures sur le séquençage du génome tardigrade ont filtré de contamination en utilisant une vaste informatique méthodes12,20, ils ont séquencé le génome d’un seul individu pour minimiser les risques de contaminations. Comme un tardigrade individuel contient environ 50-200 pg d’ADN génomique16</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Nozomi Abe, Yuki Takai et Nahoko Ishii pour leur soutien technique dans le séquençage génomique. Ce travail a été soutenu par la subvention pour la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI subvention des jeunes scientifiques (No.22681029) et KAKENHI subvention pour la recherche scientifique (B), n° 17 H 03620 de la JSPS, par un Subventions pour projets de recherche base scientifique de la Fondation Sumitomo (No.140340) et en partie par le Fonds de recherche du gouvernement Yamagata de la préfecture et ville de Tsuruoka, Japon. Chlorella vulgaris utilisé pour nourrir les tardigrades était une gracieuseté de Chlorella Industry Co. Ltd.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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