Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa
Summary
Identificação de variantes genéticas contribuindo para doenças humanas complexas nos permite identificar novos mecanismos. Aqui, vamos demonstrar uma abordagem de genotipagem multiplex de genes candidatos ou análise de percurso de gene que maximiza a cobertura de baixo custo e é passível de estudos de coorte-baseado.
Abstract
Doenças complexas são muitas vezes sustentadas por múltiplas variantes genéticas comuns que contribuem para a suscetibilidade a doenças. Aqui, descrevemos uma abordagem de polimorfismo (SNP) de nucleotídeo único marca econômica usando um ensaio de genotipagem multiplexado com espectrometria de massa, para investigar associações de caminho do gene em coortes clínicas. Vamos investigar o locus de candidato de alergia alimentar Interleukin13 (IL13) como um exemplo. Este método eficiente maximiza a cobertura, tirando proveito do desequilíbrio de ligação partilhada (LD) dentro de uma região. Selecionado LD SNPs então destinam-se em um ensaio multiplexado, permitindo até 40 SNPs diferentes a serem analisados simultaneamente, aumentando a rentabilidade. Reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para amplificar os loci de alvo, seguido pela extensão de nucleotídeo único, e os amplicons são então medidos usando a laser assistida por matriz dessorção/ionização-tempo flight(MALDI-TOF) espectrometria de massa. A saída bruta é analisada com o genótipo de chamar o software, usando as definições de controle de qualidade estritas e cortes, e genótipos de alta probabilidade são determinados e saídos para análise de dados.
Introduction
Em doenças humanas complexas, variantes genéticas contribuem para a suscetibilidade a doenças e quantificar essas variantes pode ser úteis para a patogênese da compreensão, identificação de grupos de pacientes de alto risco e tratamento respondentes. Na verdade, a promessa da medicina de precisão é dependente utilizando Informação Genômica para identificar subgrupos de pacientes1. Infelizmente, dentro do espaço de biologia doença complexa, onde os fenótipos de doença são sustentados por heterogeneidade genética substancial, baixa penetrância e expressividade variável, coorte tamanho requisitos para abordagens de todo o genoma identificar romance os candidatos são frequentemente prohibitively grande2. Alternativamente, uma abordagem de gene alvo candidato começa com uma hipótese um priori sobre genes/percursos específicos na etiologia de doença3. Ferramentas de análise de percurso são comumente usadas para investigar a fisiopatologia de um loci alvo identificado, gerando numerosas vias de candidato a ser explorado. Demonstramos aqui uma abordagem de genotipagem multiplexada, permitindo a investigação de dezenas a centenas de SNPs com um ensaio, adequado para estudos de coorte humana4. Esta abordagem é relativamente elevado através de colocar, permitindo que centenas de milhares de amostras de DNA para ser genótipo para estudos de nova descoberta e investigação de percursos específicos. Os métodos descritos aqui são úteis para identificar alelos de risco e suas associações com características clínicas de forma relativamente rápida e barata. Esta plataforma tem sido altamente vantajosa para triagem e diagnóstico fins5,6e, mais recentemente, para infecção microbiana7 e papilomavírus humano8.
Este protocolo começa com a seleção de um conjunto de genes para investigação, i. e., as regiões de destino, geralmente determinadas por meio de pesquisa de literatura, ou um priori hipóteses para o envolvimento no processo de doença; ou talvez selecionado para replicação como as principais associações de um estudo de associação de genoma-largo (GWA) descoberta. Do conjunto de genes, o pesquisador irá selecionar uma lista refinada da marca SNPs. Ou seja, o desequilíbrio de ligação (LD), ou correlação, entre variantes na região é usado para identificar um representante ‘marca SNP’ para um grupo de SNPs em alta LD, conhecido como um haplótipo. O LD alta da região significa que os SNPs são herdadas muitas vezes juntos tal que a genotipagem um SNP é suficiente para representar a variação em todos os SNPs no haplótipo. Como alternativa, se a seguir uma lista definitiva de SNPs de muitas regiões, por exemplo., replicação para um estudo da GWA, este processo pode ser desnecessário. Para genotipagem multiplexada, um ensaio deve então ser projetado em torno dessas metas tais que os primers de amplificação são de massa diferindo dos primers extensão e espectros de massa de produtos para produzir interpretável. Esses parâmetros são facilmente implementados por uma ferramenta de design de ensaio de genotipagem multiplexado. Os primers para diante e reversos deste projeto serão usados para direcionar os marcadores de interesse e amplificar a sequência que contém o SNP. Os primers de extensão anexar diretamente proximal para os SNPs e é adicionada a uma base única, massa-modificado, ‘terminator’ complementar para o SNP. A base de terminator impede extensão do DNA. A massa-modificação da base permite que fragmentos, diferenciando-se por uma base única para ser detectado por espectrometria de massa. A placa contendo a química de genotipagem é então aplicada a um chip para medição em uma plataforma de espectrometria de massa. Após a aplicação de controlos de qualidade adequados para as chamadas de genotipagem cru detectadas pelo sistema, os dados podem ser exportados e utilizados para a análise estatística para testar a associação com fenótipos de doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos o método de genotipagem multiplexada utilizando espectrometria de massa. Os resultados representativos foram gerados usando PCR emparelhado com espectrometria de massa4 com química de ensaio listados na Tabela de materiais13MALDI-TOF. Com esta plataforma, geramos um total de 11.295 genótipos em 1.255 indivíduos para 9 SNPs dentro 40 h no laboratório.
Podemos ilustrar a utilidade da técnica em atender hip?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores têm sem agradecimentos.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
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