Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya
Summary
Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.
Abstract
Dorsal kök gangliyon (DRG) hücre organları duyusal sinir hücreleri içerir. Sözde tek kutuplu, çevre dokular, deri, kas ve viseral organlar yanı sıra merkezi sinir sistemi spinal dorsal boynuz gibi innervate iki aksonlar ile nöron bu türüdür. Duyusal sinir hücreleri dokunma, ağrı, termal ve amac duyumlar da dahil olmak üzere somatik duyu iletim. Bu nedenle, DRG birincil kültürler yaygın duyusuna hücresel mekanizmaları, duyusal sinir hücreleri ve sinirsel gelişim fizyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılır. Kültürlü nöronlar Elektrofizyoloji, sinyal iletimi, nörotransmitter açıklaması, ya da kalsiyum görüntüleme ile ilgili çalışmalarda uygulanabilir. DRG birincil kültürlerle bilim adamları Disosiye DRG nöronlar tek biyokimyasal değişiklikler kültür veya birden çok hücre, birçok sınırlamaları aşmak içinde vivo deneyler ile ilişkili. Ticari olarak karşılaştırıldığında kullanılabilir DRG-Hibridoma hücre hatları veya ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre hatları, kompozisyon ve primer hücre özelliklerini çok daha doku duyusal nöronların benzer. Ancak, sınırlı sayıda tek bir hayvan izole olabilir kültürlü DRG primer hücre olması nedeniyle, yüksek üretilen iş ekranlar için çalışmalar hedefleme ilaç yapmak zordur. Geçerli makalede, DRG toplama ve kültür yordamları açıklanmıştır. Buna ek olarak, biz kültürlü DRG hücreleri peptid nörotransmiterler (kalsitonin gen ile ilgili peptid (CRGP) ve madde P (SP)) sürümü ikna etmek için (NPFFR2) ile bir peptit FF reseptör tip 2 agonist tedavisi göstermek.
Introduction
Duyusal sinir hücreleri hücre organlarının DRG içinde yer alır. Bu nöronlar sözde tek kutuplu ve periferik doku ve merkezi sinir sistemi innervate. Periferik sinir uçlarının duyusal nöronların kas, cilt, viseral organlar ve diğer dokularda. arasında kemik bulunur Onlar sinir uçlarının spinal dorsal boynuz ve sinyalleri sonra somatik duyu1,2farklı artan yollar aracılığıyla beyne iletilir periferik hissi sinyalleri iletmek. Somatik duyu (yani, dokunmatik, ağrı ve ısı hissi) hissediyorum ve hareket ve mekansal oryantasyon (amac duyumları)1,3algıladıkları vücut sağlar. Dört birincil afferent aksonlar da dahil olmak üzere, alt sınıflarını Grup ben proprioception iskelet kas, deri mechanoreceptors için yanıt Grup II (Aβ) lifler yanıt ve Grup III (Aδ) (Aα) lifler ve acıya yanıt Grup V (C) lifler ve sıcaklık. Diğer farklı derece myelinated sadece C lifleri unmyelinated, iken.
Nociceptors doku hasarı için potansiyel taşıyan zararlı uyaranlara (mekanik, termal ve kimyasal uyarımı) tarafından etkinleştirilen birincil duyusal sinir hücreleri vardır. Bu nöronlar myelinated Aδ lifleri ile unmyelinated C lifleri1,4oluşur. Aδ lifleri sinir büyüme faktörü (NGF, trkA reseptör), CGRP ve SP. reseptörleri hızlı C lifleri peptidergic ve peptidergic C lifleri sınıflandırılır. Öte yandan, peptidergic C lifleri reseptörleri gliyal kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, RET ve GFR reseptörleri), isolectin IB4 ve ATP-gated iyon Kanal alt türü (P2X3)5,6,7için hızlı. Nociceptors iyon kanalları ifade tarafından seçkin ve nörotrofik faktör tarafından aktive,8sitokinler, nöropeptitler, ATP veya diğer kimyasal bileşikler. Stimülasyon, nörotransmiterler, CGRP, SP ve glutamat gibi spinal dorsal boynuz nosiseptif sinyalleri2iletimi için duyusal nöron terminallerinden serbest bırakmak. DRG sadece nöronlar oluşan değildir, aynı zamanda uydu Gliyal hücreler içerir. Uydu hücreleri duyusal sinir hücreleri çevreleyen ve mekanik ve metabolik destek9,10sağlar. İlginçtir, DRG uydu Gliyal hücreler ağrı hissi11düzenlenmesinde tutulabilir gösteren kanıt büyüyen bir gövdesi vardır.
Duyusal sinir hücreleri en sık kullanılan birincil nöronal hücre12 ve Elektrofizyoloji, sinyal iletimi ve nörotransmitter yayın çalışmaları için kullanılan rapor. Bunlar da yaygın nöronal gelişim, enflamatuar ağrı, nöropatik ağrı, cilt hissi (gibi kaşıntı) ve akson akıbet12,13,14,15hücresel mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. DRG birincil kültürler deneysel bireylerde gerçekleştirilen çalışmalar gerçekleştirmek bilim adamları sağlayan biyokimyasal değişimler tek veya birden fazla hücre değerlendirmek için Disosiye nöronlar olarak kültürlü. Son zamanlarda, DRG başarıyla kültürlü insan organ bağış hangi büyük ölçüde translasyonel araştırma16yarar olabilir. DRG explants olarak Öte yandan, duyusal sinir hücreleri de kültürlü. DRG explants nöronlar Schwann hücreleri ve uydu gliyal hücrelerini de dahil olmak üzere, özgün doku mimarisini korumak ve nöronal ve nöronal olmayan hücreleri17arasındaki etkileşimler çalışma kullanışlıdır. DRG birincil kültürler içinde 2,5 h kolayca hazırlanabilir. Özellikleri ve hücre kompozisyon kaynağı DRG yüksek oranda yansıtıcı ve bu nedenle, belirli DRG (lomber veya torasik DRG) deneysel talepleri doğrultusunda toplanabilir. Embriyonik ve neonatal DRG nöronlar kültürleri NGF hayatta kalmak ve akson akıbet teşvik istemek, ama yetişkin nöronlar kültürleri medya12,17Nörotrofik faktörler eklenmesi gerekmez. Ayrıca gibi deneysel hayvan kullanımı gerektirmeyen ND7/23 ve F11, piyasada bulunan DRG-Hibridoma hücre hatları vardır. Ancak, geçici reseptör potansiyel katyon eksikliği kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) ifade (küçük duyusal nosiseptif nöronlar için önemli bir işaretleyici) ve uyumsuz gen ifade profilleri sınırlamak onların uygulamaları18. Son zamanlarda, are lâyık ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre satırlarını fare (50B11)19 elde edilmiş ve fare (MED17.11)20, yüksek üretilen iş ekranları için çalışmalar hedefleme ilaç kullanın. Ancak, bu hücre satırları için profil oluşturma Gen ifadesinin henüz yapılması gerekiyor. Böylece, duyusal sinir hücreleri ölümsüzleştirdi bu hücrelere karşılaştırarak doğrulama deneyler devam etmektedir.
NPFFR2 DRG sentezlenmiş ve duyusal sinir terminallere spinal dorsal boynuz21translocated. Bu makalede, biz bel DRG hücre kültürü çalışmalarının ve onları nörotransmitter, CGRP ve SP. sürümü ikna etmek için NPFFR2 bir agonist ile tedavi için bir protokol sağlar NPFFR2 bağımlılığını daha fazla olan kültürlü DRG hücrelere transfected NPFFR2 küçük müdahale RNA (siRNA), kullanılarak test edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut makalede, biz toplanması, enzim-ayrılma ve sıçan lomber kültürünü göstermek DRG. NGF Nörotrofik destek ile akson DRG nöron hücre tohum sonra 3 gün içinde genişletilmiş. Hücre için hücre soma sentezlenmiş ve akson lifleri taşınan CGRP protein lekeli sonra genişletilmiş aksonlar açıkça gözlemlenebilir. Uydu da genişletilmiş, hücrelerin nöronlar gün içinde çevrelemek bölen bu Gliyal hücreler izin süreçleri. Bu iletişim kuralı tarafından yetiştirilen birincil DRG hücreleri d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. M. Calkins İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu eser Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1F0482), Chang Gung Üniversitesi, sağlıklı yaşlanma Araştırma Merkezi (EMRPD1G0171) ve Bakanlığı Bilim ve teknoloji (105-2320-B-182-012-MY2) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
