Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser cultivados em isolamento no laboratório de mídia gerado, muitos não podem, em parte porque eles podem confiar em relações simbióticas com outros micróbios, crescem muito lentamente, ou exigem condições que não podem ser replicadas em um ambiente de laboratório. Porque evita a necessidade de cultivo e é relativamente barato e de alta produtividade, baseada em sequência filogenética caracterização das amostras microbianas ambientais e associado anfitrião tornou-se um método preferido para análise do comunidade microbiana composição.

A seleção de tecnologias de sequenciamento apropriados fornecidos por vários próxima geração (NGS) plataformas¹ de sequenciamento é dependente de necessidades dos usuários, com importantes fatores incluindo: cobertura desejada, comprimento de amplicons, espera-se comunidade diversidade, bem como taxa de erro, leia-comprimento e o custo-por-gerência/megabase de sequenciamento. Outra variável que precisa ser considerado em experimentos de sequenciamento baseado em amplicon é que gene vai ser amplificado e que as primeiras demão serão usadas. Quando projetando ou escolhendo as primeiras demão, pesquisadores muitas vezes são forçados a fazer compensações entre a universalidade da amplificação e a resolução taxonômica realizáveis dos amplicons resultante. Por esta razão, estes tipos de estudos muitas vezes escolheram primers e marcadores que alvejar seletivamente subconjuntos específicos da microbiome. Avaliando a composição das comunidades bacterianas é comumente realizado por sequenciamento de uma ou mais das regiões hipervariáveis do bacteriana 16S rRNA gene^2,3. Neste estudo, descrevemos um amplicon baseado sequenciamento protocolo desenvolvido para uma plataforma NGS região alvos a 500 bp V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, que permite ampla amplificação de táxons bacterianas, proporcionando também variabilidade suficiente para distingui entre diferentes táxons. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso com outros conjuntos de cartilha, tais como os alvos o marcador ITS2 de fungos ou a subunidade de rRNA 18S de eucariotas.

Enquanto outras abordagens tais como espingarda metagenômica, metatranscriptomics e sequenciamento de célula única, oferecem outras vantagens, incluindo genomas microbianas resolvidas e medida mais direta da função da Comunidade, estas técnicas são normalmente mais caro e computacionais do que os perfis filogenética descrevem aqui⁴. Além disso, realizando metagenomics espingarda e metatranscriptomics em amostras de raiz produz uma grande percentagem de leituras pertencentes ao genoma vegetal hospedeiro, e métodos para superar esta limitação ainda estão sendo desenvolvidos^5,6.

Tal como acontece com qualquer plataforma experimental, criação de perfil baseada em amplicon pode introduzir um número de possíveis enviesamentos que devem ser considerados durante a análise de dados e projeto experimental. Estes incluem os métodos de coleta de amostra, DNA extração, seleção de primers PCR e como é realizada a preparação da biblioteca. Diferentes métodos podem significativamente afetar a quantidade de dados utilizáveis gerados e podem também prejudicar os esforços para comparar os resultados entre os estudos. Por exemplo, o método de remoção de bactérias rizosfera⁷ e a utilização de técnicas diferentes de extração ou escolha de extração de DNA a kits^8,9 foram mostrados para impacto a jusante análise, que leva a conclusões diferentes sobre os quais os micróbios são presente e suas abundâncias relativas. Desde a criação de perfil baseada em amplicon pode ser personalizada, fazer comparações entre estudos pode ser um desafio. O projeto de Microbiome terra sugeriu que pesquisadores estudando sistemas complexos tais como a planta associada microbiome beneficiaria o desenvolvimento de protocolos padronizados como um meio de minimizar a variabilidade causada pela aplicação de diferentes métodos entre estudos^10,11. Aqui, discutimos muitos dos tópicos acima e oferecer sugestões sobre as melhores práticas onde apropriado.

O protocolo demonstra o processo de coleta de solo rizosfera e amostras de raiz de Sorghum bicolor e extrair DNA usando uma bem-estabelecida kit isolamento de DNA¹¹. Além disso, o nosso protocolo inclui um fluxo de trabalho sequenciamento detalhado amplicon, usando uma plataforma NGS comumente utilizada, para determinar a estrutura das comunidades bacterianas^12,13,14. Este protocolo foi validado para o uso em uma ampla gama de hospedeiros de planta em um recente estudo publicado das raízes e rizosfera associado-solos de 18 espécies de plantas, incluindo Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum¹⁵. Este método também foi validado para uso com outros genes marcadores, como demonstrado pela sua aplicação bem sucedida para estudar o gene marcador ITS2 fúngico em estudos do agave microbiome^16,17 e microbiome morango ¹⁸.