Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

Associées aux plantes microbiomes se composent des communautés microbiennes dynamiques et complexes, composées de bactéries, archées, virus, champignons et autres micro-organismes eucaryotes. Outre leur rôle bien étudié en provoquant des maladies des plantes, associées aux plantes microbes peuvent également influencera phytosanitaire en améliorer la tolérance aux stress biotiques et abiotiques, promouvoir la disponibilité des nutriments et l’amélioration de la croissance des plantes par le biais la production des phytohormones. Pour cette raison, un intérêt particulier existe pour caractériser les taxons qui associent à la plante racine endosphères, rhizosphères et le sol environnant. Alors que certains microbes peuvent être cultivés dans un isolement sur milieux généré de laboratoire, beaucoup ne peuvent pas, en partie parce qu’ils peuvent compter sur des relations symbiotiques avec d’autres microbes, poussent très lentement, ou nécessitent des conditions qui ne peuvent pas être répliquées dans un environnement de laboratoire. Parce qu’il contourne la nécessité pour la culture et est relativement peu coûteux et haut-débit, profilage phylogénétique basé sur séquence d’échantillons microbiens environnementaux et liés à l’hôte est devenue une méthode de choix pour doser la communauté microbienne composition.

La sélection des technologies de séquençage approprié fourni par divers prochaine génération séquençage (NGS) plates-formes¹ repose sur les besoins des utilisateurs, avec des facteurs importants dont : couverture désirée, longueur de l’amplicon, attendu communautaire diversité, ainsi que le séquençage de taux d’erreur, lire-la longueur et le coût-par-run/megabase. Une autre variable qui doit être examinée dans les expériences de séquençage axée sur l’amplicon est quels gènes seront amplifiés et quelles amorces seront utilisés. Lors de la conception ou choix d’amorces, chercheurs sont souvent contraints d’opérer compromis entre l’universalité de l’amplification et la résolution taxonomique réalisable depuis les amplicons qui en résulte. Pour cette raison, ces types d’études choisi souvent des amorces et des marqueurs qui ciblent sélectivement des sous-ensembles spécifiques du microbiome. Évaluation de la composition des communautés bactériennes est couramment exécutée par séquençage un ou plusieurs des régions hypervariables des bactérienne 16 s rRNA gene^2,3. Dans cette étude, les auteurs décrivent un amplicon basé le séquençage protocole développé pour une plate-forme NGS région du gène de l’ARNr 16 s bactérienne, qui permet une amplification large de taxons bactériens tout en offrant une variabilité suffisante pour cibles les 500 bp V3-V4 distinguer les différents taxons. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour l’utilisation avec d’autres paires d’amorces, telles que celles qui visent le marqueur ITS2 de champignons ou de la sous-unité d’ARNr 18 s des eucaryotes.

Tandis que d’autres approches comme fusil métagénomique, metatranscriptomics et séquençage des unicellulaires, offrent des autres avantages notamment résolu de génomes microbiens et une mesure plus directe de la fonction communautaire, ces techniques sont généralement plus cher et par le calcul intensif que le profilage phylogénétique décrites ici⁴. En outre, exécutant fusil métagénomique et metatranscriptomics sur des échantillons de racines donne un pourcentage élevé de lectures appartenant au génome de la plante hôte, et des méthodes pour contourner cette limitation sont toujours développés^5,6.

Comme avec n’importe quelle plateforme expérimentale, axée sur l’amplicon profilage peut introduire un certain nombre de biais potentiels qui doivent être considérés lors de l’analyse de données et la conception expérimentale. Il s’agit de méthodes de prélèvement d’échantillons ADN extraction, choix des amorces de PCR et comment la préparation de la bibliothèque est effectuée. Différentes méthodes peuvent avoir un impact significativement la quantité de données utilisables générées et peuvent aussi entraver les efforts visant à comparer les résultats entre les études. Par exemple, la méthode d’élimination de bactéries rhizosphère⁷ et l’utilisation de techniques d’extraction différente ou choix de DNA extraction kits^8,9 montrent significativement en aval l’étude d’impact, ce qui conduit à conclusions différentes concernant les microbes sont présents et leur abondance relative. Étant donné que le profilage basé sur amplicon peut être personnalisé, faire des comparaisons entre les études peut être difficile. La terre Microbiome Project a suggéré que les chercheurs qui étudient les systèmes complexes comme le microbiome associées aux plantes bénéficieraient de l’élaboration de protocoles normalisés comme un moyen d’atténuer la variabilité causée par l’application de différentes méthodes entre études^10,11. Ici, nous discutons beaucoup des thèmes ci-dessus et approprié de présenter des propositions quant à où les meilleures pratiques.

Le protocole montre le processus de collecte de sol rhizosphère et échantillons de racines de Sorghum bicolor et extraction ADN à l’aide d’un kit isolement d’ADN bien établi¹¹. En outre, notre protocole inclut un flux de travail de séquençage détaillé amplicon, utilisant une plate-forme NGS couramment utilisée, pour déterminer la structure des communautés bactériennes^12,13,14. Ce protocole a été validé pour l’usage dans une large gamme de plantes-hôtes dans une récente étude publiée des racines, rhizosphère et associés-les sols de 18 espèces de monocotylédones dont Sorghum bicolor, Zea mays et Triticum aestivum¹⁵. Cette méthode a également été validée pour être utilisé avec d’autres gènes marqueurs, comme en témoigne son application réussie à l’étude du gène de marqueur ITS2 fongique dans les études de l’agave microbiome^16,17 et fraise microbiome ¹⁸.