Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Gabriella Panuccio; Ilaria Colombi; Michela Chiappalone

doi:10.3791/57548

JoVE Journal > Neuroscience

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신경과학

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Published: May 15, 2018

doi:

10.3791/57548

Gabriella Panuccio¹, Ilaria Colombi¹, Michela Chiappalone^1,2

¹Department of Neuroscience and Brain Technologies,Istituto Italiano di Tecnologia, ²Rehab Technologies,Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un’interfaccia di utente grafica personalizzata.

Abstract

Epilessia del lobo temporale (TLE) è la più comune sindrome epilettica complessa parziale e il meno sensibile ai farmaci. Stimolazione cerebrale profonda (DBS) è un approccio promettente quando il trattamento farmacologico non riesce o neurochirurgia non è raccomandato. Fettine di cervello acuto accoppiate a matrici di microelettrodi (MEA) rappresentano uno strumento prezioso per studiare le interazioni di rete neuronale e loro modulazione da stimolazione elettrica. Rispetto alle tecniche convenzionali registrazione extracellulare, che forniscono il vantaggio aggiunto di un maggior numero di punti di osservazione e una distanza nota Inter-elettrodo, che permettono di studiare il percorso di propagazione e velocità di elettrofisiologici segnali. Tuttavia, l’ossigenazione dei tessuti può essere notevolmente alterata durante MEA registrazione, che richiede un tasso alto di aspersione, che arriva al costo di rapporto segnale-rumore in diminuzione e superiore oscillazioni della temperatura sperimentale. Stimolazione elettrica ulteriormente sottolinea il tessuto cerebrale, che lo rende difficile da perseguire epoche di registrazione/stimolazione prolungata. Inoltre, elettrica modulazione dell’attività cerebrale fetta deve fare riferimento a specifiche strutture/vie all’interno della slice di cervello, che richiedono che il mapping di elettrodo facilmente e rapidamente eseguite dal vivo durante l’esperimento. Qui, vi illustriamo come eseguire la registrazione ed elettrica modulazione di 4-aminopiridina (4AP)-ha indotto l’attività epileptiform in fettine di cervello del roditore utilizzando MEAs planare. Indichiamo che il tessuto cerebrale ottenuti da topi supera il tessuto di cervello di ratto e così è più adatto per esperimenti MEA. Questo protocollo garantisce la generazione e la manutenzione di un modello stabile epileptiform che fedelmente riproduce le caratteristiche elettrofisiologiche osservate con registrazione potenziale campo convenzionale, persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta stimolazione elettrica per epoche prolungate. Redditività dei tessuti in tutto l’esperimento è raggiunta grazie all’utilizzo di una camera di registrazione personalizzato piccolo-volume consentendo per flusso laminare e lo scambio di soluzione rapida anche a bassa (1 mL/min) velocità di perfusione. Veloce MEA mapping per monitoraggio in tempo reale e selezione degli elettrodi di stimolazione viene eseguito da un’interfaccia di utente grafica personalizzata (GUI).

Introduction

L’epilessia è un disordine progressivo pericolosa causando attività incontrollata del cervello¹; trasporta tra il più alto carico di malattia e stigma sociale significativo²^,³. TLE è la sindrome più frequente (40%) e il più frequentemente (~ 30%) resistente ai farmaci anti-epilettici⁴. Mentre l’ablazione chirurgica del tessuto epilettogeno può migliorare la condizione del paziente, non è fattibile in tutti i pazienti e non può garantire una vita completamente grippaggio-libero⁵. Modulazione delle reti epilettici limbiche di DBS elettrico è un approccio promettente quando trattamento farmacologico o neurochirurgia non sono adatti.

Fette del cervello del roditore sono uno strumento prezioso per studiare la funzione di reti come un neurone nella salute e nella malattia⁶ per mezzo di tecniche di elettrofisiologia in vitro , come conservare, almeno in parte, l’architettura originale e la connettività del cervello regioni di interesse (ROI). In particolare, orizzontale combinato ippocampo-entorhinal corteccia (ippocampo-CE) fette comprendono le essenziali reti neuronali coinvolte in TLE e pertanto sono abitualmente impiegati in vitro TLE ricerca⁷.

Attività di grippaggio-come può essere indotta acutamente nelle fette del cervello modificando la composizione ionica del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), come la diminuzione di magnesio mentre aumenta il potassio⁸^,⁹^,¹⁰, o per mezzo di manipolazioni farmacologiche, come il blocco di attività inibitoria GABAergica (Vedi¹¹ per una rassegna completa). Tuttavia, questi modelli sono basati sull’alterazione sbilanciato di eccitazione ed inibizione; Pertanto, non consentono lo studio della interazione e concertata contributo delle reti eccitatorie ed inibitorie a ictogenesi. Migliora la perfusione continua di fette del cervello con il farmaco convulsivante 4AP neurotrasmissione sia eccitatori che inibitori, permettendo così di studiare ictogenesi acuta pur mantenendo intatta la attività sinaptica nel complesso¹².

MEAs consentono di registrare l’attività elettrica generata da reti neuronali da un maggior numero di punti di osservazione rispetto al potenziale registrazione campo extracellulare convenzionale, dove restrizioni spaziali limitano il numero di elettrodi che possono essere accomodato sulla superficie della fetta del cervello. Inoltre, MEA chip offrono il vantaggio aggiunto di distanza inter-elettrodo nota, che è molto utile alla propagazione di traccia e valutare la velocità di viaggio di segnali registrati. Anche se inizialmente concepito per la registrazione da neuroni coltivati¹³^,¹⁴, MEAs ora sono anche usate per caratterizzare le caratteristiche elettrofisiologiche di fettine di cervello acuto ottenuti da roditori¹⁵ e gli esseri umani¹⁶. Così, nel contesto della ricerca di epilessia, MEAs rappresentano uno strumento prezioso per individuare interazioni delle reti neuronali alla base del ictogenesi¹⁶^,¹⁷^,¹⁸.

Tuttavia, registrazione MEA trasporta inerentemente sfide tecniche nell’ottenere o mantenere un modello stabile epileptiform in tutta protocolli sperimentali lunga (diverse ore). In primo luogo, l’ossigenazione dei tessuti può non essere adeguato all’interno del grande e sommerso di registrazione camera¹⁹^,²⁰ tipici di MEAs commercialmente disponibili, mentre povero rapporto segnale-rumore e instabilità della temperatura potrebbe influenzare la qualità della registrazione quando un tasso elevato di aspersione (6-10 mL/min) è utilizzato per migliorare l’apporto di ossigeno per la fetta di cervello (Vedi ad esempio le note tecniche su riscaldamento e perfusione attrezzature²¹). In secondo luogo, il ricorrenti gli scarichi con componenti ad alta frequenza, quali scarichi epileptiform, difficilmente sono osservati quando si utilizza tipo sommerso registrazione Colombo¹⁹; Questo è specialmente il caso quando il pattern epileptiform acuta è chimicamente indotta e coinvolge meccanismi ephaptic, come è il caso per il modello 4AP²² (Vedi¹¹ per una panoramica completa). Per superare queste limitazioni, sono state proposte diverse strategie dai ricercatori. Ad esempio, aumentando il tasso di aspersione¹⁹^,²⁰ , riducendo lo spessore fetta di cervello (≤ 300 µM) e zona¹⁷^,¹⁸ è fattori cruciali per il raggiungimento di un’adeguata di ossigeno al tessuto. Inoltre, migliore cervello fetta attuabilità è possibile anche utilizzando perforato MEAs (pMEAs), che permettono che irrora il tessuto cerebrale da entrambi i lati di¹⁸.

Considerando che gli approcci descritti hanno notevolmente migliorato la fattibilità di registrazione MEA da fettine di cervello, essi non sono stati testati contro prolungato (diverse ore) sedute di stimolazione elettrica e registrazione, quest’ultima rappresentando un significativo stress per il tessuto cerebrale. Sessioni di registrazione prolungato potrebbero essere necessario studiare l’evoluzione nel tempo delle caratteristiche specifiche di modelli epileptiform che non sarebbe possibile smascherare tramite le misure a breve termine. Nel contesto della ricerca DBS, protocolli sperimentali prolungati potrebbero essere necessario valutare e confrontare gli effetti di diversi paradigmi di stimolazione nella stessa fetta di cervello.

Quando solo un’attività elettrica spontanea deve essere registrata, mappatura degli elettrodi per quanto riguarda il ROI è di solito fatto a posteriori, cioè, durante l’analisi dei dati; invece, lo studio delle risposte evocate o dei paradigmi di neuromodulazione elettrica richiede che stimolazione consegnato a specifici ROI(s), dettando la necessità del mapping di facile e veloce dal vivo elettrodo durante l’esperimento.

Qui, vi illustriamo un semplice protocollo sperimentale che permette per induzione e il mantenimento di un modello stabile epileptiform 4AP-indotta nelle fette del cervello del roditore adulto. L’attività osservata riproduce fedelmente le caratteristiche elettrofisiologiche di questo modello come caratterizzato utilizzando tecniche di elettrofisiologia extracellulari convenzionali. E persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta la stimolazione elettrica per ripetute epoche prolungate. Gli alloggiamenti utilizzati per mantenere e incubare le fette di cervello possono essere montati facilmente utilizzando standard di laboratorio forniture (Figura 1A), considerando che una camera di registrazione personalizzato consentendo una soluzione ottimale tasso di cambio e a flusso laminare (Figura 1B) può essere ottenuti da fonti commerciali o utilizzando la tecnologia di stampa 3D ad un prezzo abbordabile. Mappatura rapida di ROI(s) per il monitoraggio in tempo reale e per la selezione degli elettrodi di stimolazione è reso possibile da un’interfaccia molto intuitiva personalizzata denominata mapMEA, liberamente disponibili su richiesta.

Figura 1: attrezzatura personalizzata utilizzata per questo protocollo. (A) la detenzione alloggiamenti per recupero, pre-riscaldamento e pre-incubazione in 4AP sono assemblati con un bicchiere e una capsula di Petri. Di Petri deve essere di diametro inferiore l’interruttore e viene tenuto in posizione per mezzo di un pistone della siringa. Fondo di Petri è sostituito da una rete di nylon (da morbide calze) incollata con cianoacrilato sul cerchio del piatto Petri. Ossigeno è fornito tramite un ago spinale piegato (22 G), inserito tra le pareti di Petri e il becher. Bolle dovrebbero essere emergenti dal lato del bicchiere e mai raggiungere la rete di nylon per evitare lo spostamento di fetta di cervello. Parte superiore di una capsula di Petri può essere usato come coperchio per evitare l’evaporazione ACSF e mantenere la saturazione di ossigeno. Camera di registrazione personalizzata di (B). in: serbatoio di aspirazione per ospitare la cannula di riscaldamento e l’elettrodo di riferimento. fuori: serbatoio di presa per ospitare l’ago di aspirazione. Camera di REC: registrazione. Pipetta Pasteur di vetro (C), arricciata di fuoco-lucidatura, utilizzato per gestire il tessuto e regolarne la posizione all’interno della camera di registrazione. Ancoraggio di Hold-Down fetta Custom (D). Il montaggio finale (E) della camera di registrazione montato sul chip MEA. Una fetta di cervello poggia sul fondo tenuto dal punto di ancoraggio. La freccia rossa indica la tubazione di PTFE che copre la cannula di riscaldamento, mentre il cerchio rosso indica l’elettrodo di riferimento, un pellet di KCl saturo sommersa da ACSF nel serbatoio di aspirazione. La freccia blu indica l’ago di aspirazione del serbatoio di scarico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Ministero della salute (autorizzazione n. 860/2015-PR) in conformità con la direttiva UE 2010/63/CE sul benessere degli animali. 1. preparazione dell’Assemblea camera MEA/Custom Nota: Iniziare 2 giorni prima dell’esperimento. Utilizzare un MEA senza un anello (Vedi Materiali tavolo). Pulire il MEA (durata: 35-40 min). Sciogliere una polvere detergente enzimatica in acqua distillata tiepida. Spazzolare la calda pulizia soluzione sulla superficie MEA quindi impregnano il MEA nella calda pulizia soluzione per almeno 3 ore. Sciacquare il MEA accuratamente con acqua distillata e asciugarlo con un panno privo di lanugine no-scratch. Assemblare il MEA con la camera di registrazione (durata: 10 min + pernottamento). Distribuire uniformemente il sigillante elastomerico sulla superficie inferiore della camera di registrazione. Assicurarsi che non vi siano bolle. Montare la camera di registrazione sulla MEA con l’aiuto di pinzette e applicare una leggera pressione. Se ci sono eventuali bolle, alzare leggermente la camera in un cerchio esercitando una leggera pressione con le dita fino a quando tutte le bolle sono scomparse. Stendere uno strato di sigillante tutto intorno il bordo esterno della sezione registrazione.Nota: critico! Non coprire i contatti MEA con il sigillante. Collocare il gruppo MEA dell’alloggiamento all’interno di una capsula di Petri di 15 cm. Posto a 5 mL di Petri o un becher da mL 10 riempito con acqua distillata vicino il MEA. Coprite il tutto per mantenere un ambiente umido. Lasciate che la cura a temperatura ambiente durante la notte.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Rivestire il MEA per renderlo idrofilo (durata: 5-10 min + pernottamento). Inserire il MEA un 15cm di Petri. Versare 50 µ l di poli-D-lisina sull’area di registrazione di MEA. Chiudere la piastra di Petri, sigillare con pellicola sigillante e conservare durante la notte a 4 ° C. Sciacquare accuratamente con acqua distillata la MEA e conservare la MEA a 4 ° C in acqua distillata.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. MEAs rivestiti possono essere memorizzati e riutilizzato per diversi esperimenti. Ordinariamente pulizia e ri-rivestimento il MEA aiuta a rimuovere i detriti dei tessuti e migliorare il rapporto segnale-rumore. 2. preparazione delle soluzioni madri Nota: Avviare 1 giorno prima dell’esperimento (durata: ~ 2 h). Soluzioni di riserva aiutano accelerare l’esperimento il giorno sperimentale. Possono essere preparati in anticipo e archiviati. Vedere la tabella 1 per la composizione e il fattore di concentrazione. Riferimento alla tabella 2 per la composizione di soluzioni finali. Sciogliere le sostanze chimiche in acqua distillata a temperatura ambiente. Le soluzioni di riserva con una bottiglia di filtro del filtro (filtro di diametro: 0,22 µm). Conservare a 4 ° C (Vedi tabella 1 per raccomandato il tempo massimo di conservazione).Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. 3. preparazione dell’Agar Nota: Avviare 1 giorno prima dell’esperimento (durata: ~ 1 h). Versare 250 mL di acqua distillata in un becher da mL 500 e iniziare mescolando a 350 giri/min. Aggiungere 5 g di agar e attendere fino a quando è completamente sciolta. Riscaldare la soluzione a 250-300 ° C. Evaporare l’acqua fino a quando la soluzione è ~ 200 mL per produrre una soluzione di 2,5% w/v agar.Nota: La temperatura deve essere abbastanza alta da lasciare che l’acqua evapori senza bolle. Versare la soluzione di agar in una scatola quadrata in plastica 200 mL di ~1.5 pareti alte cm e lasciate raffreddare a temperatura ambiente fino a quando diventa solido. Coprire la casella e conservarla a 4 ° C. Il blocco di agar è buono per diverse settimane.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. 4. preparazione del piano congelato Nota: Avviare 1 giorno prima dell’esperimento. Riempire una ciotola di acciaio inox a fondo piatto con acqua distillata fino a 0,5 – 1 cm sotto il bordo. Conservare a-20 ° C durante la notte. 5. preparazione di Neuroprotective taglio ACSF Nota: Avviare 1 giorno prima dell’esperimento o lo stesso giorno dell’esperimento (Vedi tabella 1 e tabella 2) (durata: 30 min). Versare 200 mL di acqua distillata in un becher da mL 500 e iniziare a mescolare con un agitatore magnetico a 350 giri/min. Aggiungere 50 mL di brodo B e 50 mL di brodo C (Vedi tabella 1). Aggiungere 3 mM acido piruvico, saccarosio 208 mM, 10 mM D-glucosio e acido L-ascorbico di 1 mM.Nota: Il volume effettivo di acido piruvico dipende dalla densità e purezza e può variare con il batch. Sempre calcolare il volume richiesto quando si apre un nuovo batch. Coprire con pellicola sigillante e lasciare sotto agitazione per 30 minuti. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL e aggiungere acqua distillata per riempire il pallone. Sigillare il matraccio tarato con pellicola sigillante e capovolgere delicatamente 3 – 5 volte fino a quando la soluzione è uniformemente chiara. Trasferire il taglio ACSF in una bottiglia di vetro con tappo. Memorizzare il taglio ACSF a-80 ° C per 20-30 min o a 4 ° C durante la notte per raffreddare fino a 4 ° C.Nota: Il protocollo può essere sospesa qui se il raffreddamento durante la notte è preferito. In caso contrario il tempo necessario per il taglio ACSF di raffreddamento può essere utilizzato per perseguire il passaggio 6. 6. preparazione dell’azienda ACSF Nota: Preparare la soluzione fresca il giorno dell’esperimento (durata: 5-10 min). La holding ACSF verrà utilizzato per sciacquare le fette di cervello dal taglio ACSF durante la procedura di taglio (Vedi punto 8.16) e per immagazzinaggio a lungo termine di fetta di cervello e pre-riscaldamento. Per sciacquare le fette di cervello, 100 mL di detenzione ACSF è sufficiente. Gli alloggiamenti di holding e pre-riscaldamento utilizzati in questo protocollo sono realizzati su misura e contengono un volume di 300 mL e 100 mL, rispettivamente (cfr. Figura 1A). Con questa impostazione, 500 mL di holding ACSF è sufficiente. Camere ottenute da fonti commerciali possono contenere un volume diverso, in cui caso l’importo complessivo della holding ACSF essere preparato deve essere regolata di conseguenza. Versare 200 mL di acqua distillata in un matraccio tarato da 500 mL. Aggiungere 50 mL di brodo A, 50 mL di brodo B, 6,5 mL di brodo M e 1 mM acido L-ascorbico. Agitare delicatamente con movimenti rotatori fino a quando l’acido L-ascorbico è completamente sciolto. Aggiungere acqua distillata per raggiungere il volume finale, sigillare il matraccio tarato con pellicola sigillante e capovolgere delicatamente 3 – 5 volte fino a quando la soluzione è uniformemente chiara. Riferimento alla tabella 2 per la holding composizione ACSF. 7. preparazione delle panchine sperimentale Nota: Questo richiede 15 min, più 30 minuti per ottenere una temperatura costante del bagno caldo. Banco di registrazione Avviare il bagno caldo, impostarlo a 32 ° C e coprirlo per mantenere la sua temperatura.Nota: Il bagno caldo utilizzato nel presente protocollo può essere su misura utilizzando una scatola di plastica dura e un termostato acquario pre-regolato alla temperatura desiderata. Costante temperatura desiderata può essere raggiunto in ~ 30 min a partire da temperatura ambiente. Poiché le camere di pre-riscaldamento e incubazione sedersi nella parte inferiore della scatola di plastica, il livello dell’acqua dovrebbe essere appena sufficiente a coprire il termostato in modo da mantenere gli alloggiamenti di galleggiamento. Assemblare la detenzione e gli alloggiamenti del pre-riscaldamento (cfr. Figura 1A) e versare la detenzione ACSF in loro. Tenere la camera di tenuta a temperatura ambiente e posizionare la camera di pre-riscaldamento all’interno della vasca calda. Avviare bubbling le soluzioni con miscela di gas di 95% O25% CO2 e rimuovere eventuali bolle intrappolate usando una pipetta di Pasteur invertita. Tenere coperto. VIBRATOME e panca per affettare Incollare un blocco di agar piccolo al centro del disco di preparato usando la colla del cianoacrilato. Mettere un becher da 250 mL in un secchio di ghiaccio e versare ACSF di taglio in esso. Prendere due bicchieri di 100ml e versare 50 mL di holding ACSF in ciascuno. Lasciare le provette a temperatura ambiente. Queste sono le coppe di risciacquo. Avviare bubbling le soluzioni con una miscela di gas di 95% O25% CO2 . Montare il tampone del vibratome e circondano con ghiaccio tritato. Versare alcuni etanolo su ghiaccio tritato per aiutare a mantenere le temperature fredde durante la procedura di taglio. Dopo versando etanolo, aggiungere altro ghiaccio se necessario.Nota: Una temperatura di 2 ° C è ottima. Posizionare la vasca di gorgogliamento dentro la vasca del buffer, quindi assemblare e montare il blocco lama vibratome.Nota: Assicurarsi che la lama sia collocata all’angolo di spoglia inferiore di circa 10°. Mettere il ghiaccio tritato in un becher da mL 500 fino a 2/3 del volume e riempire con acqua distillata. Prendere il bicchiere gelato fuori dal freezer, collocarlo capovolto sulla panchina per affettare e coprirla con un tovagliolo di carta e un disco di carta da filtro. Banco di anestesia Mettere una piccola ciotola in un vassoio pieno di ghiaccio e versare ACSF di taglio in esso. Inizio spumeggiante con una miscela di gas di 95% O25% CO2 . 8. brain Slice preparazione e manutenzione Nota: Il presente protocollo si avvale di adulto (4 – 6 settimane-vecchio) topi CD1 maschii, ma altri ceppi (ad es., c57/bl617,18) possono essere utilizzato. Confrontiamo anche dopo l’uscita sperimentale ottenuta con fettine di cervello di topo con quello risultante dalla fette del cervello ottenute da ratti Sprague-Dawley maschi della stessa età. I passi seguenti si riferiscono alla preparazione di fette di cervello parzialmente disconnesso in cui CA3-driven veloce interictal-come attività è trattenuto all’ippocampo adeguato e non può propagarsi alle cortecce parahippocampal, come descritto in23. Ippocampo-corteccia disconnessione è un pre-requisito per proseguire gli studi di modulazione elettrica utilizzando la preparazione di fetta di cervello ippocampo-CE. Vibratome utilizzata si riferisce al modello elencato nella Tabella dei materiali. Altri modelli possono richiedere una procedura diversa. Anestetizzare il roditore utilizzando isoflurano 5% in un carbogen gas miscela consegnato ad una camera di induzione di anestesia a 2 L/min. Sotto anestesia profonda (riflessi in risposta ai piedi e zampe non pizzicare), estrarre il cervello entro 1 min seguendo le procedure standard come in23. Inserire il cervello la piccola ciotola contenente taglio ghiacciata equilibrato ACSF e lasciate raffreddare per 90-120 s.Nota: Non lasciare che il cervello chill per troppo a lungo, altrimenti può congelare. Versare il taglio ghiacciato ACSF in tampone. Diffondere il taglio ACSF sulla carta da filtro collocata sulla ciotola congelata. Posizionare il cervello sulla carta da filtro e isolare il blocco del tessuto di cervello richiesto rimuovendo il cervelletto e il Polo frontale di taglio dritto. Con l’aiuto di una spatola piegata, colla il lato dorsale del cervello sul disco dei campioni con il taglio lato frontale rivolto verso il blocco di agar e il Polo occipitale sia rivolto verso la lama del vibratome. Utilizzare un sottile strato di colla del cianoacrilato. Inserire il disco di preparato in tampone immediatamente e fissarli. Regolare l’intervallo di taglio in modo da spostare la lama del vibratome tutto il senso attraverso il tessuto fino al blocco di agar. Regolare l’altezza del disco esemplare per raggiungere il livello di lama con il blocco del tessuto di cervello. Scartare le sezioni di tessuto fino a quando l’ippocampo è chiaramente visibile (solitamente ~ 900 µm). Impostare un fetta dello spessore di 400 µm, quindi avviare affettare per trattenere le sezioni di tessuto. Per ogni sezione del cervello diviso i due emisferi e tagliare il tessuto inutile per ottenere due fettine di cervello. Come tampone è intensificata durante le sezioni successive, riempire alla costituzione di vassoio di tampone con acqua distillata ghiacciata (Vedi punto 7.2.7). Utilizzare una pipetta di Pasteur invertita per delicatamente trasferire le fette di cervello nel primo risciacquo Becher, svuotare la pipetta di Pasteur e trasferire le fette di cervello secondo becher di risciacquo. Trasferire le fette di cervello nella camera di tenuta, quindi far loro recuperare per almeno 60 min.Nota: Di solito è possibile ottenere 6-8 fettine di cervello globale. Il protocollo può essere messo in pausa qui. 9. preparazione di ACSF contenente 4-AP (4AP-ACSF) Nota: Questo richiede 10 minuti per la preparazione, oltre a 20 min di riscaldamento. Attenzione! 4-AP è un farmaco convulsivante ed è tossico. Gestire con i guanti ed evitare di versare. Versare 200 mL di acqua distillata in un matraccio tarato da 500 mL. Aggiungere 50 mL di brodo A, 50 mL di brodo B, 5 mL di brodo M e 1 mM acido L-ascorbico. Agitare delicatamente con movimenti rotatori fino a quando l’acido L-ascorbico è completamente sciolto. Aggiungere 500 µ l di brodo 4AP. Aggiungere acqua distillata per raggiungere il volume finale, sigillare il matraccio tarato con pellicola sigillante e si capovolgere delicatamente 3 – 5 volte fino a quando la soluzione è uniformemente chiara. Assemblare la camera di incubazione 4AP (cfr fig. 1A) e versare ~ 80 mL di 4AP-ACSF in esso. Coprire la camera, trasferirlo il bagno caldo e avviare spumeggiante con una miscela di gas di 95% O25% CO2 . Rimuovere eventuali bolle intrappolate usando una pipetta di Pasteur invertita. Tenere coperto. Attendere che la temperatura 4AP-ACSF è 30-32 ° C (~ 20 min).Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui se fette del cervello sono ancora riprendendo. 10. pre-riscaldamento e incubazione delle fette in 4AP (durata: 90 min) Controllare che il pre-riscaldamento ACSF ed la temperatura 4AP-ACSF 30-32 ° C. Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro invertito per trasferire 1 fetta di cervello nella camera di pre-riscaldamento e lasciate riposare il tessuto per 25-30 min. Quindi trasferire la fetta di cervello nella camera di incubazione 4AP-ACSF e lasciarlo riposare per 60 min. 11. preparazione dell’assetto MEA Nota: Avviare 15 min prima della registrazione. Trasferire il volume residuo di 4AP-ACSF in una beuta da 500 mL. Porre l’erlenmeyer su una mensola sopra l’amplificatore MEA e utilizzare tubi per consentire la soluzione di alimentare continuamente una siringa da 60 mL. Regolare l’altezza della beuta e la siringa per consentire un tasso di gravità di 1 mL/min.Nota: L’altezza corretta dipende il diametro interno della tubazione (ID). Per tubi di ID 5/32 pollici, 30 cm sono sufficienti. Avviare bubbling 4AP-ACSF nella beuta e la siringa con una miscela di gas di 95% O25% CO2 . Lasciate il 4AP-ACSF flusso attraverso il tubo per perfusione in un becher fino a lì non è aria all’interno; quindi arrestare il flusso di soluzione. Collegare l’elemento riscaldante alla base MEA al termostato. Posizionare il chip MEA asciutto all’interno dell’amplificatore MEA e fissare la testa di amplificatore. Utilizzare una pipetta di Pasteur plastica per trasferire 4AP-ACSF per l’ingresso e il serbatoio esterno della camera di registrazione. Fissare la cannula di riscaldamento per un supporto magnetico e posizionare la punta all’interno del porto di ingresso camera di registrazione; fissare il supporto magnetico per una banda magnetica sulla testa amplificatore MEA; Collegare il tubo per perfusione alla cannula; Collegare la cannula al termostato.Nota: La cannula di riscaldamento dovrebbe essere coperto con un tubo smussato del politetrafluoroetilene (PTFE) per raggiungere la camera di registrazione porta di ingresso e per minimizzare il rumore dovuto il materiale metallico della cannula. Quando il serbatoio di aspirazione è adeguatamente riempito con 4AP-ACSF, gocce che cadono dal sistema di perfusione non devono essere visibili. Inserire l’ago di aspirazione all’interno del serbatoio e verificare che non ci sia pressione negativa immergendo l’ago aspirazione in ACSF; controllare per un rumore di aspirazione bassa frequenza costante.Nota: L’ago di aspirazione deve essere posizionato in modo da consentire la 4AP-ACSF flusso appena sopra la superficie di fetta di cervello. Una linea del vuoto o una pompa a vuoto basso rumore può essere utilizzata. Impostare il regolatore di flusso per consentire una portata di 1 mL/min ed iniziare che irrora.Nota: Gravità aspersione Elimina il rumore che potrebbe essere causato da pompe peristaltiche; Se si preferiscono le pompe peristaltiche, basso rumore modelli sono obbligatori. Una volta 4AP-ACSF sta fluendo attraverso la cannula, accendere il termostato. Impostare la cannula di riscaldamento a 37 ° C e la base MEA a 32 ° C per raggiungere una temperatura di 32-34 ° C all’interno della camera di registrazione.Nota: attenzione! Mai il calore la cannula senza soluzione in esso o esso potrebbe essere danneggiato irreversibilmente. Impostare la temperatura della cannula superiore alla temperatura di registrazione (cioè, 32-34 ° C) per tenere conto per l’ offset di temperatura intrinseca tra il valore impostato e il valore effettivo alla punta della cannula riscaldamento e all’interno della camera di registrazione. Il tasso di flusso, temperatura ambiente e volume della registrazione dell’alloggiamento tutti fattori che influenzano la temperatura della soluzione di registrazione. Le impostazioni riportate al punto 11.9 sono ottimizzate per il protocollo descritto e attrezzature. Sempre controllare la temperatura effettiva registrazione mediante una termocoppia e regolare le impostazioni come necessario. Non riscaldare la base MEA superiore a 34 ° C per evitare il surriscaldamento della fetta di cervello. Posizionare l’elettrodo di riferimento esterno del serbatoio di aspirazione camera di registrazione.Nota: Sebbene MEA chip sono dotate di un elettrodo di riferimento interno, questo è coperto da camera di registrazione personalizzata. Pertanto, deve essere utilizzato un elettrodo di riferimento esterno. Un pellet di KCl saturo è il più pratico, dal momento che è pronto all’uso senza necessità di clorazione. 12. MEA Live Mapping Una volta il livello 4AP-ACSF e la temperatura di registrazione sono stabilizzati come desiderato, Disabilita l’aspersione e i rubinetti di aspirazione sulla posizione off per interrompere temporaneamente la loro. Trasferire rapidamente una fetta di cervello sulla camera di registrazione MEA usando una pipetta Pasteur di vetro invertito. Regolare la sua posizione nell’area di registrazione MEA come necessari utilizzando una pipetta Pasteur arricciata lucidati a fuoco (Figura 1) o un morbido pennellino compatto. Posizionare il punto di ancoraggio del Hold-Down (Figura 1) sulla fetta di cervello. Riavviare l’aspersione e l’aspirazione riportando loro rubinetti di arresto in posizione.Nota: critico! La fetta deve essere trasferita, e la perfusione riavviato entro 60 s o il tessuto potrebbe morire. L’ancoraggio di Hold-Down della fetta dovrebbe essere tenuto 4AP-ACSF per impedire che la fetta di cervello in movimento pur ponendo l’ancoraggio sulla fetta di cervello a causa di differenze di tensione superficiale. Il punto di ancoraggio per garantire la fetta di cervello sul MEA può essere su ordine usando il filo di nylon e filo in acciaio inox (Figura 1) o ottenuti da fonti commerciali. Figura 1E Mostra il set-up sperimentale finale con il chip MEA connessi alla testa dell’amplificatore: una fetta di cervello che riposa sul chip MEA all’interno della camera di registrazione viene tenuta premuto per l’ancoraggio su ordinazione. L’elettrodo di riferimento (cerchio rosso) e il PTFE tubi che copre la cannula di riscaldamento (freccia rossa) sono posizionati nel serbatoio di aspirazione, mentre l’aspirazione dell’ago (freccia blu) viene posizionato nel serbatoio di scarico. Scattare una foto della fetta del cervello utilizzando una telecamera montata su un palcoscenico di microscopio invertito. Eseguire gli script mapMEA il software del computer per avviare l’interfaccia grafica per eseguire il mapping degli elettrodi.Nota: Il software su misura permette all’utente di selezionare gli elettrodi che corrispondono a specifiche strutture della fetta di cervello. Questo passaggio è fondamentale per attivare la via corretta e sopprimere l’attività ictal mediante stimolazione elettrica. Fig 2: GUI per vivere mappatura elettrodo MEA. (A) rappresentazione schematica della fetta combinato ippocampo-CE posizionata sul MEA. Le strutture predefinite utilizzate per questo protocollo sono cornu ammonis 3 (CA3), corteccia entorinale (CE), corteccia peririnale (PC) e subiculum (SUB). L’elettrodo di riferimento è schematizzato come un marcatore di triangolo. Elettrodi circondati in linee tratteggiate rappresentano le coordinate XY per raddrizzare l’immagine. (B) Screen capture della GUI durante il live mapping di MEA. Il diagramma di flusso sulla sinistra della cattura indica la procedura dettagliata da seguire. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fare clic sul pulsante Sfoglia per caricare l’immagine della fetta del cervello. Assicurarsi che l’elettrodo di riferimento visualizzato nella riga superiore della metà-lato sinistro della MEA (Figura 2A, triangolo mark). Fare clic sul pulsante Puntatore attivare , quindi selezionare gli elettrodi superiore e inferiore nella riga a sinistra della matrice per contrassegnare le coordinate XY per la lisciatura di immagine e mapping di elettrodo. Dal menu a discesa tipo di sezione selezionare orizzontale. Spuntare la casella di controllo predefinito strutture .Nota: È possibile personalizzare le strutture selezionando il pulsante Inserisci nuove strutture . Le strutture predefinite per la sezione orizzontale del cervello sono raffigurate nella Figura 2A. Utilizzando i pulsanti numerati sotto l’immagine di fetta di cervello, seleziona gli elettrodi corrispondente al ROI e clicca il pulsante corrispondente nel pannello strutture per assegnarli (Figura 2B); Ripetere questo passaggio per ogni ROI. Premere il pulsante Salva : il software genera una cartella di risultato denominata #EXP_LabelledElectrodes contenente una tabella segnalazione gli elettrodi selezionati e ROIs. 13. registrazione ed elettrica modulazione dell’attività Epileptiform Consentire la fetta di cervello stabilizzare all’interno della camera di registrazione per 5-10 min prima della registrazione. Accendere lo stimolo unità almeno 10 min prima il protocollo di stimolazione per consentire l’auto-calibrazione e stabilizzazione. Avviare il software di controllo dello stimolo e verificare che stimolatore e MEA amplificatore siano collegati correttamente come indicato da un LED verde nel pannello principale del software di controllo dello stimolo. Consultare i manuali del software per ulteriori dettagli, cfr . Tabella dei materialie strumenti specifici. Impostare la stimolazione in configurazione bipolare. Selezionare le coppie di elettrodi a contatto con lo strato delle cellule piramidali del subiculum CA1/prossimale (cfr24,25) tra quelli mappati con gli script mapMEA (cfr. sezione 12). Utilizzare un filo per collegare uno degli elettrodi selezionati alla spina negativa lo stimolatore e l’altro elettrodo alla spina positivo dello stesso canale stimolatore. Utilizzare un altro filo per collegare la terra dello stimolatore a terra dell’amplificatore. Avviare il software di registrazione. Per acquisire dati, premere il pulsante PLAY nel pannello principale del software di registrazione. Registrare almeno 4 scarichi ictal.Nota: Una frequenza di campionamento di 2 kHz permette l’acquisizione di potenziali di campo con equa risoluzione riducendo al minimo l’utilizzo dello spazio di disco rigido. Un file di registrazione di 5 minuti prende ~ 80 MB. Frequenze di campionamento più elevate possono essere richieste, ad esempio, per registrare stimolo artefatti o multi-unità attività. Per osservare solo potenziali di campo, utilizzare un filtro passa-basso dal vivo a 300 Hz per tagliare multi-unità attività. Determinare l’intensità di stimolo. Nel software di controllo dello stimolo, è possibile utilizzare il pannello principale per progettare una durata dell’impulso corrente bifase quadrato positivo-negativo di 100 µs/fase.Nota: attenzione! Corrente continua stimolazione richiede un impulso di carica equilibrata per evitare di danneggiare l’apparecchiatura. Eseguire un rapido test di ingresso/uscita (i/o) per identificare la migliore intensità di stimolo. Fornire l’impulso di stimolazione progettato a passo 13.5.1 a 0,2 Hz o inferiore con l’aggiunta di un intervallo di Inter-impulso di 5 s o più a lungo in forma appropriata del software di controllo dello stimolo. Nella scheda Ampiezza impulso immettere un’ampiezza di impulso iniziale di 100 µA/fase e aumenta a 50-100 µA passi a ogni prova fino a quando la stimolazione in modo affidabile può evocare interictal-come gli eventi nelle cortecce parahippocampal (controllare i segnali visualizzati tramite la software di registrazione). Modulazione elettrica di ictogenesi limbica Programmare l’unità di stimolo per fornire il protocollo di stimolazione di interesse. Utilizzare l’ampiezza di stimolo identificato durante il test dei / o.Nota: Il tasso di fallimento delle risposte evocate deve essere ≤ 20%. Dopo stimolazione si interrompe, verificare il recupero a rete alla condizione pre-stimolo registrando almeno 4 scarichi ictal (come al punto 13.4).

Representative Results

MEAs planare con layout e la spaziatura di elettrodo di 500 µm 6 x 10 sono il dispositivo di registrazione ideale per il protocollo sperimentale descritto qui, poiché la loro area di registrazione si estende in tutta la fetta di cervello nella sua interezza (Figura 3A, vedi anche17). Anche se perforato MEAs (pMEAs) sarebbe preferibile per migliorare l’ossigenazione dei tessuti, la loro area di registrazione è troppo piccolo (~ 2 mm di diametro). Questo non consente la visualizzazione simultanea dei segnali elettrici generati dall’ippocampo e la corteccia paraippocampale (dati non mostrati; cfr.18). Il modello osservato epileptiform 4AP-indotta (Figura 3A) riproduce fedelmente quello che si osserva tipicamente in questo modello in vitro utilizzando registrazioni potenziali di campo convenzionale e comprende tre tipi di attività7, 26: (io) ictal-come eventi (Figura 3B, punte di freccia) sono robusta lunga durata (> 20 s, gamma: 20-60 s) eventi che assomiglia l’elettrografiche caratteristiche di attività di sequestro con tonico e cloniche componenti (Figura 3); Essi sono generati all’interno le cortecce parahippocampal ogni 3-5 min e immettere nuovamente la formazione hippocampal attraverso il giro dentato (Figura 3D, freccia); (ii) lento interictal-come gli scarichi (Figura 3B, CE trace, barra nera; espanso in Figura 3E) sono brevi (< 1 s) gli eventi di popolazione generati tra eventi ictal ubiquistmente entro la preparazione di fetta di cervello ippocampo-CE e si verificano in un lento ritmo (range 10-30 s); (iii) velocegli scarichi interictal-come (Figura 3B, CA3 traccia, barra nera; ampliato in Figura 3E) sono ricorrenti breve (< 1 s) eventi di popolazione generati dal sottocampo hippocampal CA3; Quando vengono mantenuti i collaterali di Schaffer, veloce CA3-driven interictal eventi si propagano lungo il ciclo di hippocampal ed esercitano un effetto di anti-ictogenic24 (dati non mostrati); per impedire l’attività ictal fatiscente, allo scopo del protocollo descritto, uscita CA3 è interrotta (cfr. Figura 3B, E). Deve essere notato che l’attività interictal veloce CA3-driven registrato usando MEAs si verifica a un ritmo più lento (~ 0,4 Hz) rispetto a ciò che è osservato utilizzando potenziale campo convenzionale registrazione con pipette in vetro (~ 1 Hz, gamma: 0,5 – 2,0 Hz, dati non mostrati). Il buon esito del neuromodulation elettrico nelle fette del cervello del roditore dipende dall’attivazione di specifici circuiti neuronali27 insieme la connettività intrinseca tra regioni comprese nella preparazione24. Abbiamo testato le fette ottenute da topi Sprague Dawley del maschio adulto e topi CD1 e abbiamo trovato che il mouse anziché fettine di cervello di ratto offrono il miglior compromesso tra dimensioni, spessore e connettività intrinseca. In primo luogo, grazie alle loro dimensioni più piccole, si inseriscono l’area di registrazione piccolo di MEAs commercialmente disponibile meglio (Figura 4A, sinistra: ratto, destra: mouse); in secondo luogo, essi sono più resistenti alla condizione sfavorevole che è intrinseca MEA registrazione (cfr. Introduzione): anche se gli scarichi ictal-come generato da questi due tessuti (Figura 4B) sono di durata simile (4 figura sinistra), loro tasso di occorrenza è significativamente più breve in fettine di cervello di topo (n = 10 fette di ogni specie; 2 spaiati t-test code, p < 0,001; Destra di Figura 4 ). Quest’ultimo permette di accelerare i protocolli sperimentali, che permette di testare un numero maggiore di fette del cervello durante un singolo giorno sperimentale: per questo set di risultati rappresentativi, abbiamo potuto testare un numero simile di fette del cervello dai due specie (ratto: n = 58; mouse: n = 52), ma il numero di topi (n = 18) è stato 2 volte inferiore rispetto al numero dei ratti (n = 42). Inoltre, fettine di cervello di topo sembrano presentare con connessioni più dense e pertanto sono più propensi a rispondere meglio alla neuromodulazione elettrica sostenuta (Figura 4). Così, in questo modello in vitro di ictogenesi, la redditività per la stimolazione elettrica finalizzata al controllo attività ictal è significativamente maggiore per il mouse che per il tessuto di cervello di ratto. Questo aspetto si riflette anche il significativamente più alto tasso di successo degli esperimenti di stimolazione eseguita utilizzando mouse contro fettine di cervello di ratto anche quando perseguire diversi protocolli di stimolazione sostenuta (Figura 4E). Infatti, tessuto di cervello del mouse sembra resistere meglio sostenuta stimolazione elettrica come suggerito dal più alto tasso di sopravvivenza entro i tempi sperimentali testati di 4 h (Figura 4F). Così, la taglia più piccola con la migliore conservazione della connettività intrinseca rende fette di cervello del topo il miglior candidato per eseguire MEA registrazione mirata allo studio di interazioni di rete hippocampal paraippocampale e valutare elettrico protocolli di neuromodulazione che sono rilevanti per TLE. Cadenza periodica consegnato in CA1/subiculum è noto per controllare ictogenesi limbica nell’ippocampo-CE 4AP-trattati fetta preparazione24,25,27, con 1 Hz come il più efficace di frequenza27. Così, è anche utile come controllo positivo per valutare l’efficacia e l’efficienza delle altre politiche di neuromodulazione (Vedi ad esempio25). Come accennato in precedenza, impulsi elettrici consegnati direttamente attraverso il MEA (cioè, senza la necessità di un elettrodo stimolante esterno) possono evocare le risposte di popolazione nel tessuto cerebrale dei roditori (Vedi anche28). Conservazione sufficiente della connettività di rete di un neurone all’interno della slice di cervello, posizionamento accurato della fetta del cervello sul MEA e la scelta appropriata delle coppie di elettrodo stimolante consentono di perseguire neuromodulation elettrico esperimenti che controllare efficacemente ictogenesi. Come mostrato in Figura 5A, è possibile riprodurre il canonico 1 Hz periodica stimolazione protocollo utilizzando MEAs planare sia come una registrazione un dispositivo stimolante, con il vantaggio aggiunto che l’effetto della stimolazione elettrica può essere visualizzato in tutto il sezione del tessuto di cervello con un numero superiore ugualmente distanziati di punti di osservazione rispetto alla registrazione di potenziali di campo convenzionale. Figura 5B Mostra la quantificazione dei risultati ottenuti per n = 9 fette di cervello, che indica una riduzione significativa del totale cogliendo tempo (tempo di attività ictal totale durata/osservazione25) durante la stimolazione (un modo-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, test di Fisher LSD post hoc , protetto). I risultati sono coerenti con la letteratura per esterni stimolante elettrodi24,25. Per calcolare il totale cogliendo il tempo, il tempo di osservazione dipende dall’intervallo tra eventi ictal e determina inoltre la durata minima del protocollo di stimolazione necessaria per valutare gli effetti della neuromodulazione in tutta sicurezza. Troviamo che registrare almeno 4 scarichi ictal (e quindi almeno 3 intervalli tra eventi ictal) è un buon compromesso tra campioni raccolti e insieme richiesto tempo. Nella condizione di controllo (cioè, nessuno stimolo), il tempo di osservazione è il ritardo fra l’inizio del primo evento ictal misurato e la cessazione di uno degli ultimi. Durante la neuromodulazione, il tempo di osservazione è uguale la durata del protocollo di stimolo, poiché l’obiettivo della misura è quello di quantificare i fenomeni che si verificano durante tutto il tempo che la perturbazione è stato introdotto nel sistema. Calcolo e confronto totale cogliendo tempo piuttosto che la durata e l’intervallo di eventi ictal è il parametro più adeguato per evitare l’errore di tipo II. Infatti, insieme a completa soppressione di attività convulsiva, è anche possibile che solo uno evento ictal è generato durante la stimolazione elettrica in contrasto con i diversi eventi osservati nella condizione di controllo. In questo caso, considerando che non è possibile misurare l’intervallo tra eventi, durata ictal come uno stimatore di efficacia di stimolazione di misurazione non rappresenta il risultato effettivo di neuromodulazione (cioè, riduzione di attività ictal). Nel complesso, i risultati presentati qui indicano che fette di cervello del topo accoppiati a MEAs sono strumenti preziosi per la ricerca di epilessia e di effettuare studi di neuromodulazione affidabili che sono rilevanti per avanzare il campo di DBS per il trattamento dell’epilessia. Inoltre, il protocollo descritto qui migliora la vitalità fetta di cervello e permette di perseguire sessioni sperimentali per diverse ore (Figura 6), che possono essere richieste, per esempio, al fine di confrontare gli effetti di stimolazione elettrica diversa paradigmi. Figura 3 : Tipico indotta da 4AP epileptiform modello visualizzato con passe-partout planare (A) Mouse fetta posizionato su un 6×10 MEA planare del cervello (distanza tra elettrodo: 500 µm) e side-by-side Panoramica del modello indotta da 4AP epileptiform visualizzato con registrazione di MEA. Ogni quadrato della griglia accomoda le attività registrate nella posizione corrispondente all’interno della slice di cervello. Linee tratteggiate blu si riferiscono alle righe dell’elettrodo per maggiore chiarezza. Il numero di elettrodi di registrazione viene identificato in blu nell’angolo superiore sinistro di ogni quadrato. Il grigio attraversato piazza rappresenta l’elettrodo di riferimento. (B) segmenti traccia rappresentativa dei modelli CE e CA3 visualizzati a una scala di tempo più veloce. Le frecce indicano eventi ictal. Nella traccia di CE è possibile apprezzare l’avvenimento di lento gli scarichi interictal (barra neri), mentre il sottocampo CA3 genera il modello tipico fastinterictal sostenuta (barra nera). (C) ampliato la registrazione di un scarico ictal che mostra il tipico motivo tonico-clonic. (D) visualizzazione Fast-scala della transizione pre-ictal-a-ictal corrispondente alla CE (rosso) e segmenti di CA3 (nero) traccia contrassegnata dalla barra rossa (b). La freccia indica l’inizio dello scarico ictal. Le tracce sovrapposte evidenziano che l’evento ictal ha origine nella CE e successivamente si propaga nel sottocampo CA3. (E) la vista espansa dei periodi interictal segnata dalle barre nere in (B) sottolinea la mancanza di correlazione tra il lento e fastinterictal modelli generati dalla CE (rosso) e CA3 (nero), rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Fettine di cervello del Mouse offrono una maggiore emissione sperimentale di fettine di cervello di ratto. (A) cervello fetta da un ratto (a sinistra) e un mouse (a destra) di età corrispondente. La fetta di cervello di ratto è molto più grande dell’area di registrazione di MEA e sua attività elettrica non può essere visualizzato in pieno. (B) confronto visivo diretto del ricorrente attività ictal generata dalla corteccia entorinale topo e di ratto (CE). (C) Fette di cervello di topo e di ratto generano gli scarichi ictal di simile durata, ma l’intervallo tra questi eventi è tessuto di cervello di ratto in quasi 2 volte. * p < 0.05. (D) rispetto ai ratti, topi offerta una 2 volte più alta resa di fettine di cervello vitali per esperimenti di stimolazione elettrica finalizzata al controllo ictogenesi. La stimolazione elettrica del subiculum potrebbe evocare le risposte di popolazione nelle cortecce parahippocampal in solo 20 dei 58 fettine di cervello del mouse di fette, al contrario di 33 di 52 (63%) di ratto (34%) cervello (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0.05. (E) tra fette praticabile, il tasso di successo nel controllo della attività ictal è di 2 volte con il mouse e fettine di cervello di ratto (mouse: 20 di 33 fettine di cervello, 60%: ratto: 6 di 20 fettine di cervello, 30%; Chi2: 4.67; p = 0,03). p < 0.05. Mouse (F) fette del cervello in grado di sopportare ripetuti prolungate epoche di stimolazione elettrica sostenuta (aree di grigio). Al momento del ritiro di stimolo, tessuto di cervello di topo esibisce il recupero completo del modello epileptiform, mentre vitalità del tessuto del cervello di ratto cade drammaticamente a 3 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Esperimento rappresentanza di modulazione elettrica di ictogenesi usando le fette di cervello accoppiato alla misura (A) registrazioni di attività ictal 4AP-indotta nella CE e PC durante la condizione di controllo (nessuna stimolazione), periodica di stimolazione (PP) a 1 Hz (artefatto stimolo viene troncato) e durante il recupero al momento del ritiro di stimolo. (B) quantificazione dell’effetto di PP a 1 Hz sul totale tempo di cogliere. p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Registrazione rappresentativo a lungo termine di attività ictal 4AP-induced. (A) traccia segmenti registrati 8 h dopo il cervello affettare la procedura e seguente 2h di 4AP applicazione. (B) Expanded tracciare segmenti corrispondenti per gli scarichi ictal boxed identificati dalla lettere a, be c nel pannello (A) Visualizza la coerenza dell’attività generata ictal durante tutto il tempo di osservazione prolungata-vedova. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. A Stock Prodotto chimico Peso molecolare Concentrazione (mM) NaCl 58,44 1150 Solvente: acqua distillata KCl 74.55 20 Concentrato: 10x KH2PO4 136.1 12.5 Temperatura di stoccaggio: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147,02 20 Tempo massimo di conservazione: 1 sett. D-glucosio 180.2 250 Nota: applicare un filtro utilizzando un filtro a membrana 50 mm Magazzino B Prodotto chimico Peso molecolare Concentrazione (mM) NaHCO3 84.01 260 Solvente: acqua distillata Concentrato: 10x Temperatura di stoccaggio: 4 ° C Tempo massimo di conservazione: 1 sett. Nota: applicare un filtro utilizzando un filtro a membrana 50 mm Stock in C Prodotto chimico Peso molecolare Concentrazione (mM) KCl 74.55 20 Solvente: acqua distillata KH2PO4 136.1 12.5 Concentrato: 10x MgCl2* 6 H2O 203,3 50 Temperatura di stoccaggio: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246,47 20 Tempo massimo di conservazione: 2 sett. CaCl2* 2 H2O 147,02 5 Nota: applicare un filtro utilizzando un filtro a membrana 50 mm Magazzino M Prodotto chimico Peso molecolare Concentrazione (mM) MgSO4* 6 H2O 246,47 100 Solvente: acqua distillata Concentrato: 100 x Temperatura di stoccaggio: 4 ° C Tempo massimo di conservazione: 4 wks 4AP stock Prodotto chimico Peso molecolare Concentrazione (mM) 4-aminopiridina 94,11 250 Solvente: acqua distillata Concentrato: 1000 x Temperatura di stoccaggio: 4 ° C Tempo massimo di conservazione: 2 sett. Nota: vortex per 2-3 min o mescolare per 30-60 min Nota: attenzione! 4-AP è tossica e cinvulsant. Utilizzare guanti ed evitare diffusione o fuoriuscite. Tabella 1: Soluzioni Stock. HOLDING ACSF REGISTRAZIONE ACSF TAGLIO ACSF Prodotto chimico C [mM] Prodotto chimico C [mM] Prodotto chimico C [mM] NaCl 115 NaCl 115 Saccarosio 208 KCl 2 KCl 2 KCl 2 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5 CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2 D-glucosio 25 D-glucosio 25 CaCl2 0,5 NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glucosio 10 Acido L-ascorbico 1 Acido L-ascorbico 1 NaHCO3 26 Acido L-ascorbico 1 pH 7.4 pH 7.4 Acido piruvico 3 Osmolalità 300 mOsm/Kg Osmolalità 300 mOsm/Kg pH 7.4 Osmolalità 300 mOsm/Kg Tabella 2: Composizione di soluzioni. Risoluzione dei problemi PROBLEMA CONTROMISURE Gli scarichi ictal guardare ‘blocchi’ Diminuire il tasso di aspersione e/o abbassare il volume ACSF sopra la fetta di cervello regolando la posizione dell’ago di aspirazione. Nessuna attività ictal (1) verificare che CA3-driven veloce interictal eventi non verranno propagate alla corteccia. Utilizzare un piccolo bisturi (ad es., n. 10) o un ago di recidere i collaterali di Schaffer, se necessario, ma fare attenzione a non tagliare i fili di nylon dell’ancoraggio fetta Hold-Down. Un microscopio dritto o stereo – sono più adatti, considerando che il microscopio invertito rende questo compito molto arduo. (2) verificare la fattibilità di fetta: può forte stimolazione elettrica innescare attività ictal? Attendere circa 2 h di applicazione 4AP, quindi modificare la fetta di cervello se attività ictal non si verifica. La fetta di cervello si muove quando si posiziona il punto di ancoraggio del Hold-Down (1) l’ancoraggio di fetta di rimuovere delicatamente e riposizionare la fetta di cervello. (2) verificare che l’ancoraggio di fetta è uniformemente bagnato di 4AP-ACSF. (3) rimuovere il 4AP-ACSF dalla camera di registrazione per favorire l’adesione di fetta di cervello per la MEA. (4) riposizionare l’ancoraggio di Hold-Down della fetta. La fetta di cervello galleggia sul chip MEA dopo essere stato trasferito (1) aspirare delicatamente ACSF in eccesso con una pipetta Pasteur. (2) circuito integrato il MEA potrebbe essere necessario essere nuovamente rivestiti. Stimolazione elettrica non suscitare le risposte di rete Aumentare l’intensità dello stimolo, modificare le coppie di elettrodi. Stimolazione elettrica può suscitare risposte di popolazione nelle aree corticali prossimale ma non distale Il problema è ikely a causa di scarsa connettività o intensità dello stimolo troppo basso. Stimolazione elettrica può essere efficace o inefficace in alcune aree corticali solo. Si raccomanda di modificare la fetta di cervello. Segnale è rumoroso (1) controllare l’elettrodo di riferimento: basale rumoroso a volte può essere causato da incompleto riempimento del serbatoio di aspirazione, tale che gli elettrodi di riferimento fa non completamente dentro il ACSF. (2) controllare la messa a terra generale dell’attrezzatura. (3) regolare la posizione dell’ago di aspirazione in modo da sentire un suono di aspirazione costante, morbido. Terra l’ago di aspirazione. (4) pulire i contatti esterni di MEA con etanolo usando un batuffolo di cotone. (5) the MEA chip potrebbe essere danneggiato: cambiare MEA chip e controllare gli artefatti e il rapporto segnale-rumore. Tabella 3: risoluzione dei problemi.

Discussion

MEAs sono uno strumento prezioso per le indagini di neurofisiologia e hanno raggiunto la maturità negli ultimi anni grazie a decenni di esplorazione e sviluppo. Rispetto alla registrazione di potenziali di campo convenzionale, MEAs offrono il grande vantaggio di un maggior numero di punti di osservazione e la distanza inter-elettrodo nota, che sono cruciali per individuare con precisione interazioni di rete neuronale.

La tecnica di registrazione MEA può essere accoppiata anche ad altri approcci di elettrofisiologia, quali registrazione toppa-morsetto¹⁵, per indagare il rapporto tra singolo neurone e attività di rete di un neurone. Inoltre, la possibilità di visualizzare contemporaneamente potenziali di campo e attività multi-unità può fornire preziose intuizioni la correlazione tra l’attività di un neurone piccoli ensemble e collettive reti neuronali. La combinazione con coloranti di tensione-sensibili, calcio imaging e optogenetica²⁹ permette la deduzione di fenomeni di neurofisiologia utilizzando approcci poliedrici. Oltre a studi farmacologici, la possibilità di eseguire la registrazione e la stimolazione con lo stesso sistema rende la tecnica di registrazione MEA molto potente e versatile: ad esempio, è possibile studiare i fenomeni di plasticità sinaptica presso il nucleo di memoria formazione³⁰, utilizzando i protocolli di neuromodulazione qui presentati, che sono rilevanti per DBS per trattare l’epilessia e un’ampia varietà di disordini del cervello. La prova recente che la tecnica di registrazione di MEA possa essere applicata correttamente al cervello epilettico umano tessuto¹⁶ dimostra suo inestimabile utilità nella ricerca di epilessia, sia per capire i meccanismi di base alla base di questa malattia devastante e per ottimizzare gli algoritmi DBS per migliorare esso.

Tuttavia, MEAs forzare la ricerca di esperimenti di elettrofisiologia in condizioni di «limite» per fette del cervello, dovuto il requisito di una camera di registrazione sommerso e la necessità di lasciare il cervello fetta resto su substrato solido dove i micro-elettrodi sono integrati. Così, tessuto cerebrale non riceva adeguata di ossigeno, che a sua volta può influenzare la qualità delle registrazioni.

Il protocollo descritto qui permette di registrare in modo affidabile e studiare ictogenesi in roditore reti limbiche accoppiate a MEAs utilizzando il modello di acuta 4AP in vitro e di perseguire prolungate epoche di stimolazione elettrica, che forniscono informazioni rilevanti per la valutazione delle politiche DBS.

Gli studi precedenti sulla neuromodulazione elettrica delle reti limbiche epilettici basato sull’uso di registrazione potenziale campo convenzionale hanno usato fettine di cervello di topo o ratto con simili risultati²⁴^,²⁵; ma l’uso del tessuto di cervello di ratto si è rivelato più impegnativo, ragionevolmente a causa della connettività più debole rispetto al tessuto cerebrale ottenuti da topi⁷. Per quanto riguarda la tecnica MEA, fettine di cervello di topo sono più adatti in virtù della loro dimensione più piccola. Inoltre, dato il più alto tasso di occorrenza degli scarichi ictal-come nel topo contro il tessuto del cervello del ratto, è possibile testare significativamente più fette del cervello in tutto un giorno sperimentale, che a sua volta rende la raccolta di dati più veloce ed efficiente, e può ridurre il numero di animali utilizzati.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:

Gli scarichi ictal registrati usando la camera personalizzata descritta qui sembrano essere simili in durata e tasso di incidenza a quelli osservati con la camera di cottura convenzionale di MEA e dello stesso tipo MEA (micro-elettrodi planari, cf. ¹⁷). Tuttavia, deve essere dato risalto a che spessore della fetta di cervello deve essere ridotta significativamente quando la registrazione circolare convenzionale nella camera insieme con una tariffa bassa perfusione (1 mL/min), che può ostacolare il riuscito inseguimento di neuromodulazione esperimenti causa di scarsa connettività.

In questo protocollo, una camera di registrazione personalizzato basso volume ispirata patch clamp registrazione camera design fornisce stabile e affidabile flusso laminare che è cruciale per il riuscito inseguimento di registrazioni MEA; permette inoltre di aumentare lo spessore della fetta di cervello fino a 400 µm al fine di raggiungere un giusto compromesso tra vitalità del tessuto e connettività intrinseca. È infatti riconosciuto quel flusso laminare della soluzione di registrazione all’interno della camera è altamente desiderabile per elettrofisiologia del cervello fetta, poiché non è influenzato dalla temperatura, ossigeno, e gradienti di pH che si osservano nella circolare-flusso rotondo registrazione Colombo¹⁹^,²⁰^,³¹ (come quelli forniti con MEA disponibile in commercio). Tali pendenze introducono sperimentale polarizzazione e sono anche dannose per la fetta di cervello. Alloggiamenti di registrazione di un volume relativamente piccolo (~1.5 mL) insieme a una perfusione ad alta velocità (5-6 mL/min)¹⁶^,³¹ consentano adeguato scambio del mezzo aspersione (≥ 3 volte / min). La camera di personalizzato può essere facilmente ottenute da fonti commerciali ad un prezzo accessibile o prodotte internamente utilizzando tecnologia di stampa 3D. Altri studi hanno riferito le registrazioni MEA da 400 fette di cervello umano µm di spessore¹⁶ utilizzando la camera di cottura convenzionale MEA, mantenendo il volume ACSF a 1 mL e l’applicazione di un tasso elevato di aspersione (5-6 mL/min) con l’aiuto di una pompa peristaltica di basso rumore. Tuttavia, gli autori hanno utilizzato un diverso modello di ictogenesi, cioè, il basso Mg^{2 +}, che è probabilmente che meno influenzata rispetto al modello 4AP ephaptic meccanismi che comportano un aumento significativo nella concentrazione extracellulare di K⁺ ¹¹ ^, ²². abbiamo trovato che un tasso elevato di aspersione non è desiderabile nel modello 4AP, possibilmente dovuto il lavaggio veloce fuori di K extracellulare accumulato⁺, che potrebbe essere necessario essere aumentato significativamente nella registrazione ACSF¹⁶. Infatti, eventi ictal è sembrato più ‘blocchi’ quando ASCF aspersione velocità è stata aumentata a 2-3 mL/min e la fetta di cervello è stata sommersa da uno spesso strato ACSF, mentre scarichi conclamati espositrici robusti componenti tonico-clonic potrebbero essere ripristinati dopo il ritorno a un basso tasso di aspersione (1 mL/min) e una più sottile ACSF strato destra a livello superficiale del tessuto (dati non mostrati). La camera di registrazione personalizzato descritta in questo protocollo consente lo scambio il medium di perfusione 3 – 5 volte / min ad una portata di 1 mL/min. Così, il rifornimento di ossigeno complessiva per le fette di cervello è fortemente migliorato anche a tassi relativamente bassa perfusione, pur garantendo una stabile registrazione temperatura e alto rapporto segnale-rumore. La cosa più importante, è possibile mantenere la concentrazione extracellulare di K⁺ per un valore fisiologico.

Il modello 4AP di ictogenesi non richiede alcuna modifica significativa della composizione ionica ACSF, come abbassamento Mg^{2 +} o crescente K⁺e offre un vantaggio unico di mantenere intatte le trasmissioni sia eccitatori che inibitori ¹², un aspetto che è molto rilevante nella ricerca di epilessia alla luce del ruolo cruciale delle reti di neuroni GABAergici in sincronizzazione epileptiform (cfr. ⁷) e glutamatergic. Il 4AP-ACSF utilizzata nel presente protocollo contiene una concentrazione fisiologica di K⁺ (3,25 mM) e una Mg^{2 +} concentrazione leggermente inferiore rispetto alla detenzione ACSF (1 mM contro 1,3 mM). Questa concentrazione ancora rientri nei valori fisiologici segnalati di concentrazione di Mg^{2 +} nel roditore CSF e viene utilizzato in molti laboratori (Vedi ad esempio¹⁷^,¹⁸). Lo scopo del protocollo descritto, abbiamo trovato che questa lieve diminuzione è preferita per aiutare nell’effetto di 4AP.

Nel precedente lavoro, 4AP è stato applicato per la fetta di cervello quando era già posizionato all’interno le registrazione camera¹⁷^,¹⁸. A meno che lo sperimentatore deve osservare la latenza di tempo tra l’applicazione 4AP e l’insorgenza di epileptiform modelli, troviamo che questo approccio è piuttosto lungo e non è adatto a perseguire la registrazione prolungata e sedute di stimolazione descritto in questo protocollo. Pre-incubazione delle fette di cervello in 4AP a 32 ° C consente risparmiando tempo molto sperimentale, poiché fette del cervello possono essere pre-trattati della serie pur perseguendo l’esperimento utilizzando altre sezioni di tessuto.

La redditività prolungata delle fette del cervello può essere utile per analizzare le caratteristiche di rete nel lungo termine. Inoltre, la loro resilienza migliorata alla stimolazione elettrica ripetitiva è di grande vantaggio se lo sperimentatore vuole confrontare diversi protocolli di stimolazione, che devono essere eseguiti nella stessa fetta di cervello per robustezza statistica. Nelle nostre mani, quando 3 protocolli di stimolazione di prova, ciascuno preceduto da una fase di controllo e seguita da una fase di recupero, l’esperimento può durare 3-5 h. In questo contesto, mappe in tempo reale MEA è fondamentale al fine di attivare la via corretta e sopprimere, piuttosto che favorire ictogenesi tramite stimolazione elettrica. Il nostro user-friendly GUI rappresenta uno strumento rapido, semplice e flessibile per mappare gli elettrodi di strutture cerebrali differenti. Al contrario di software commerciale, è possibile aggiungere layout personalizzati MEA anche con competenze di programmazione di base. Immagini possono essere acquisite nel campo luminoso; così, qualsiasi fotocamera di uso generale che ha buona risoluzione e si inserisce su un microscopio è adatto. Un microscopio invertito è essenziale per visualizzare la posizione di microelettrodi rispetto la fetta di cervello, poiché questi sarebbero nascoste sotto il tessuto se si usa un microscopio in posizione verticale. Tuttavia, un impianto stereo-microscopio è consigliabile oltre al tipo invertito se lo sperimentatore deve eseguire tagli di coltello per interrompere specifici circuiti neuronali.

Infine, un ulteriore vantaggio dell’approccio proposto è l’Assemblea relativamente semplice ed economico della maggior parte degli strumenti necessari, come la camera di registrazione personalizzata e gli alloggiamenti di detenzione, il bagno caldo e l’ancoraggio di fetta, come pure l’uso inutile di un costoso pompa peristaltica a basso rumore.

Limiti della tecnica:

Registrazione di MEA non consente di visualizzare le onde molto lente, cioè, DC si sposta nel segnale. Tali deviazioni della linea di base possono aiutare a misura asintotica di scarico ictal durata e, più importante, sono fondamentali per lo studio di depressione di diffusione corticale (un fenomeno che riguarda la morte inattesa improvvisa nell’epilessia³² e viene condiviso tra l’epilessia ed emicrania³³).

Per quanto riguarda neuromodulation elettrico, il protocollo qui descritto consente di effettuare diverse sessioni di stimolazione senza colpire l’attuabilità di fetta di cervello. Abbiamo potuto eseguire con successo fino a 3 sedute di stimolazione di 20-45 min, simile a quanto indicato nel precedente lavoro²⁵. Anche se fette del cervello probabilmente possono sopportare un maggior numero di sessioni di stimolazione o protocolli di stimolazione più a lungo, abbiamo non prova fette del cervello a questo proposito. Si consiglia di limitare il numero di protocolli di stimolazione a 3 ed evitando prolungate sessioni di stimolazione (≥ 60 min), che possono significativamente lo stress del tessuto di cervello conservato in queste condizioni limite, fino alla mancanza di recupero al momento del ritiro di stimolo.

Fasi critiche all’interno del protocollo:

Diversi fattori critici possono ostacolare il riuscito inseguimento di registrazione e la modulazione dell’attività epileptiform in fettine di cervello accoppiato a MEA. Oltre la specie di roditori utilizzati e la qualità delle fette di cervello, il tasso di aspersione durante la registrazione e la dinamica del flusso ACSF (cioè., laminare contro circolare) all’interno della camera di registrazione, abbiamo trovato che le condizioni di recupero e manutenzione a lungo termine di fette del cervello così come la modalità di applicazione 4AP sono le fasi più critiche.

Quando si utilizza una camera sommersa è cruciale memorizzare le fette di cervello a temperatura ambiente per preservare le attività di rete di tessuto cerebrale e favoriscono l’induzione degli scarichi ictal-come da 4AP applicazione. Nelle nostre mani, recupero e manutenzione a 32 ° C si è deteriorato il tessuto cerebrale all’interno di 3-4 h di affettatura.

Incubazione del cervello fette in 4AP-ACSF a temperatura ambiente e registrazione a 32 ° C è, tuttavia, non auspicabile. Abbiamo trovato molte difficoltà nell’osservare gli scarichi ictal ricorrenti robusti in questa condizione. Infatti, basse temperature nell’intervallo 20-24 ° C sono state segnalate per smorzare o addirittura prevenire 4AP-indotto ictogenesi entrambi in vitro³⁴ ed in vivodi³⁵. Così, le temperature di incubazione e registrazione 4AP devono rientrare entro i 30-34 ° C e devono essere adeguate. Per evitare di mettere il tessuto cerebrale sotto troppo stress dovuto l’induzione simultanea di ipereccitabilità di 4AP e l’improvvisa esposizione delle fette del cervello dalla temperatura ambiente per il caldo (32 ° C) 4AP-ACSF, è fondamentale eseguire un pre-riscaldamento intermedio passo e lasciare che le fette di cervello habituate nell’azienda ACSF al 32 ° C per 20-30 min, saltare questo passaggio potrebbe influire sulla induzione di ictogenesi di 4AP.

Un altro aspetto che deve essere menzionato è l’importanza della concentrazione di D-glucosio nel ACSF dopo il taglio. Una concentrazione di 25 mM conserva le fette di cervello meglio di concentrazione 10 mM usata in molti laboratori e migliora anche il tasso di ricorrenza dell’attività convulsiva, che è 2 volte più veloce (, rendendo così più facile perseguire una lunga serie di sperimentale protocolli in parecchie fette di cervello ogni giorno).

Infine, alcuni importanti dettagli durante la procedura d’affettatura bisogno di essere menzionato. In primo luogo, non consentono il cervello intatto e le fette di cervello di congelare al freddo taglio ACSF. Agghiacciante il cervello per < 2 min è sufficiente date le piccole dimensioni del cervello del mouse. Sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente da tampone per il risciacquo Becher a temperatura ambiente. Sciacquare il taglio ACSF è molto importante che altrimenti la concentrazione di saccarosio alta farà il cervello fette stick per la rete di nylon della camera della holding. Per sciacquare efficacemente il tessuto, è importante per ridurre al minimo il contenuto ACSF di taglio all'interno della pipetta di trasferimento in modo da non contaminare la detenzione ACSF eccessivamente. 2 stadi di risciacquo aiuta a minimizzare la contaminazione. Al completamento della procedura per affettare, sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente dal risciacquo bicchieri alla camera di tenuta, dove il morbido nylon mesh sospesa a metà strada nell'azienda ACSF permette l'ossigenazione dei tessuti su entrambi i lati. Lo stesso principio deve essere applicato in tutte le fasi, seguendo la procedura per affettare: fettine di cervello non dovrebbero mai sedersi nella parte inferiore del bicchiere, non dovrebbero essere a contatto con i lati delle sezioni della holding e non dovrebbe mai essere in contatto tra loro, né si sovrappongono.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

ACSF composizione può essere modificata secondo le esigenze dello sperimentatore. Ad esempio, farmaci possono aggiungersi a sezionare il contributo di neurotrasmettitori specifici o scanalature dello ione per l’efficacia della neuromodulazione elettrica. Inoltre, piruvico e acido ascorbico (cfr. tabella 2) può essere omesso, anche se troviamo che esercitano un ruolo neuroprotective potenti. Segnaliamo in tabella 3 i problemi più comuni che si possono incontrare in questo protocollo e come trattare con loro.

CONCLUSIONI:

Registrazione di MEA è senza dubbio una tecnica insostituibile per affrontare le interazioni delle reti neuronali nella salute e nella malattia. Oltre a studi farmacologici, è anche possibile valutare il neuromodulation elettrico protocolli che sono rilevanti per DBS applicato a epilessia e altri disturbi neurologici. In questo protocollo, abbiamo indicato che è possibile riprodurre gli esperimenti di stimolazione periodica tipica con risultati simili a quelli ottenuti con la registrazione di potenziali di campo extracellulare convenzionale e gli elettrodi di stimolazione esterna. La crescente disponibilità di attrezzature di facile utilizzo e strumenti software avanzati rendono adatto anche per gli esperimenti di stimolazione del ciclo chiuso, per fornire lo stimolo ad hoc per il tessuto cerebrale e per la tecnica di registrazione di MEA studiare il contributo dei meccanismi di feedback alle risposte di rete di un neurone.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

G.P. è Marie Skłodowska-Curie Fellow finanziato dal progetto Unione europea MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, nell’ambito del programma quadro H2020. La mapMEA GUI è liberamente disponibile su richiesta all’autore ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Poly-D-Lysine	Sigma-Adrich	P7886	Needed for MEA coating
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Chemical
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Chemical
KH₂PO₄	Sigma-Adrich	795488	Chemical
CaCl₂*2 H₂O	Sigma-Adrich	C3306	Chemical
D-Glucose	Sigma-Adrich	RDD016	Chemical
NaHCO₃	Sigma-Adrich	S5761	Chemical
MgCl₂*6 H₂O	Sigma-Adrich	M2670	Chemical
MgSO₄*6 H₂O	Sigma-Adrich	M5921	Chemical
Sucrose	Sigma-Adrich	RDD023	Chemical
Pyruvic Acid, 98%	Sigma-Adrich	107360	Chemical
4-aminopyridine	Sigma-Adrich	A78403	Convulsant drug
STG-2004	Multichannel System	STG4004-1.6mA	4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060	Multichannel System	N/A	MEA amplifier
planar MEA	Multichannel System	60MEA500/30iR-Ti w/o ring	Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack	Multichannel System		Recording software
McStimulus II	Multichannel System		STG4004 control software
TC02	Multichannel System	TC02	2-channel thermostat
PH01	Multichannel System	PH01	Heating perfusion canula
MPH	Multichannel System	MPH	Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43	Wacker	E43	Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber	Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Enzymatic cleaner
MATLAB	The Mathworks		Programming environment for electrodemapping
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

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Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).