Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs
Summary
Toeprinting целями для измерения способности в vitro транскрипции РНК формы перевода инициации комплексов с рибосомами при различных условиях. Этот протокол описывает метод для млекопитающих РНК toeprinting и могут быть использованы для изучения Кап зависимых и управляемая IRES перевод.
Abstract
Начало перевода является шагом ограничения скорости синтеза белка и представляет собой ключевой точку, в которой клетки регулируют их производства белка. Регуляции синтеза белка является ключом к сотовой стресс реакция, и регуляции является центральным элементом многих государств болезни, как рак. Например хотя сотовой стресс приводит к ингибированию глобальной перевод смягчающих Кап зависимых инициирования, некоторые белки стресс реакция выборочно переводятся в Кап независимым образом. Сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовой внутренних рибосома запись сайтов (IRESes), позволяют для перевода этих конкретных мРНК. Идентификация такими мРНК и характеристика механизмов их регулирования, были одной из ключевых областей в молекулярной биологии. Toeprinting — это метод для изучения структуры РНК и функции, как она относится к инициации перевода. Цель toeprinting – оценить способность в vitro транскрипции РНК сформировать стабильные комплексы с рибосомами под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы участвуют в рибосомы Привязка — предварительно курсор для инициирования эффективного перевода. Наряду с других методов, таких как Западная анализа и Полисома профилирования toeprinting позволяет для надежной характеристика механизмов для регулирования возбуждения перевода.
Introduction
Как перевод потребляет наиболее клеточной энергии, это имеет смысл, что перевод является жестко регулируемых1. И наоборот, регуляции перевода- и последующего изменения объема белка-часто наблюдается в реакции на стресс и болезни государствах, таких как рак1,2. Основным преимуществом трансляционная управления является скорость, с которой клетки могут изменить их вывода белка для того, чтобы реагировать на различные раздражители3. Таким образом, перевод правил представляет собой важный механизм, который может повлиять на выживание клетки и смерти1,2,3. Шагов, перевода начало является наиболее высоко регулируемые и сложных3. Короче говоря наиболее эукариотические мРНК содержат 5′ м7G колпачок, который почти всегда необходима для их перевода. Кап зависимых посвящения требует эукариотических инициации факторов eIF4E, eIF4A и eIF4G (Кап признание комплекс) взаимодействовать с 5′ конца мРНК. 43S preinitiation рибосомы комплекс, который содержит eIF2-прыгните инициатор тРНК и eIF3, привлекается к 5′ концу мРНК через взаимодействие eIF4G с eIF3. Считается, что preinitiation комплекс сканирования мРНК, опираясь на eIF4A (РНК-helicase) до начала кодон (Авг) расположен. 48S инициации комплекс впоследствии формируется и тРНК доставляется в P-сайт рибосомы. Наконец субблоки рибосома 60 и 40 объединились в начала 80-х годов комплекс, следуют перевод удлинение1,3,4. В отличие от внутренних рибосома запись сайтов (IRESes) обойти требование для 5′ Кап, привлекая рибосомных субблока 40 лет непосредственно до начала кодон3. Физиологический стресс условиями ослабление глобальной мРНК перевод из-за изменения ключевых общих эукариотических инициации факторов (eIFs). Однако механизмы инициации неканонических перевод позволяют выборочный перевод некоторых мРНК, которые часто кодируют белки стресс реакция, и dysregulation неканонических перевод посвящения замешан в государствах заболевания как рак 1 , 2. сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовые IRESes, позволяют для перевода таких mRNAs2,3.
Особенно интересным аспектом трансляционная управления — понять механизмы канонической против не канонический перевод заданный мРНК. Toeprinting — это метод, который позволяет детальное изучение механистический начало перевода конкретных РНК в пробирке. Общая цель toeprinting заключается в том, чтобы оценить способность РНК, представляющих интерес для nucleate формирования перевод посвящения, комплекс с рибосома под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы, необходимые для начала эффективного перевода. К примеру рибосома набора может быть препятствуют в отсутствие крышкой 5′ но стимулируется наличием IRES.
Принцип метода заключается в пробирке транскрибировать РНК интерес, проинкубируйте его присутствии клеточных экстрактов, содержащих перевод компонентов (или очищенный) чтобы транскрибировать инициации комплексы форме и обратить вспять РНК с конкретным грунт. Стабильные комплексы РНК рибосома приведет к обратной транскрипции зависает на краю 3′ рибосомы так называемые «toeprint»5,6,7.
В этот протокол, рибосомных субблоков, eIFs, tRNAs и IRES транс-Исполняющий обязанности (ITAFs) удобно факторов, кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ). Еще одно преимущество этого протокола является использование дневно меченых грунт и флуоресценции формирователя изображений на основе геля, а не radiolabeled грунтовка. Это устраняет дополнительные шаги, включая radiolabeling грунт, а также сушки геля и подвергая его активизация экран. Люминесцентных полосы регистрируются в режиме реального времени, как работает гель, позволяющий для большей резолюции. Раскрытый Х-хромосомой Ингибитор апоптоза РНК IRES белка (XIAP) используется в качестве примера здесь, хотя ограничен мРНК также могут быть проанализированы по этой технике8.
В отличие от западных анализ, который измеряет конечный результат процесса перевода в lysates клетки, toeprinting является подход в vitro для измерения перевода инициации комплекс формирования на РНК. Этот упрощенный подход позволяет весьма детальное изучение субстратов или факторов, которые регулируют перевод посвящения (например., ограничен или ООН ограничен мРНК, IRES структуру, наличие или отсутствие поли A хвост, предоставление конкретных белковых факторов, и т.д.). Таким образом toeprinting может использоваться для изучения различных видов перевод8 или эффекты мРНК структур, таких как IRESes, синтез белков9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting – это мощный метод непосредственно измерить РНК интерес способность поддерживать образование комплексов инициации перевода высоко контролируемых обстоятельствах. Этот протокол описывает упрощенную технику для toeprinting РНК у млекопитающих. Кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ) исполь?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась естественных наук и инженерно-исследовательский совет Канады-Discovery Грант (RGPIN-2017-05463), Канадский фонд для инноваций-Джон р. Эванс лидеров фонда (35017), инновационную программу кампуса Альберта и в министерстве Альберты Экономического развития и торговли.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
