En alternativ metode til at studere primære begivenheder i Neurodegeneration ved hjælp af Ex Vivo rotte hjernen skiver
Summary
Vi præsenterer en metode, der kan give yderligere indsigt i de tidlige begivenheder underliggende neurodegeneration og baseret på den etablerede ex-vivo hjerne teknik, kombinerer fordelene i vivo og in vitro- eksperimenter. Desuden, det repræsenterer en enestående mulighed for direkte sammenligning af behandlede og ubehandlede gruppe samme anatomiske plan.
Abstract
På trods af talrige undersøgelser, der forsøger at udvikle pålidelige dyremodeller som afspejler primære processer underliggende neurodegeneration, kan meget få er blevet bredt accepteret. Her foreslår vi en ny procedure tilpasset fra den velkendte ex vivo hjernen skive teknik, som giver en tættere i vivo-ligesom scenario end in vitro- præparater, for at undersøge de tidlige begivenheder udløser celle degeneration, som observeret i Alzheimers sygdom (AD). Denne variant består af simple og let at reproducere trin, hvorved bevarelsen af de anatomiske cytoarchitecture af regionen valgte hjernen og dens lokale funktionalitet i en fysiologisk milieu. Forskellige anatomiske områder kan fås fra den samme hjerne, giver mulighed for at udføre flere forsøg med de pågældende behandlinger på et websted-, dosis- og tidsafhængig måde. Potentielle begrænsninger, som kan påvirke resultaterne relateret til denne metode er relateret til bevarelse af væv, dvs, vedligeholdelse af sin anatomiske integritet under udskæring og inkubering trappe og snittykkelse, som kan påvirke den biokemiske og immunhistokemisk analyse. Denne fremgangsmåde kan anvendes til forskellige formål, såsom at udforske molekylære mekanismer involveret i fysiologiske eller patologiske betingelser, stof screening eller dosis-respons assays. Endelig, denne protokol kan også reducere antallet af dyr, der er ansat i adfærdsmæssige undersøgelser. Programmet rapporteret her har været for nylig beskrevet og testet for første gang på ex vivo rotte hjernen skiver indeholdende den basale forhjernen (BF), som er en af de cerebrale regioner primært påvirket i Annoncen. Specifikt, er det blevet påvist, at administrationen af et giftigt peptid afledt af C-terminus af acetylcholinesterase (AChE) kunne bede en annonce-lignende profil, langs antero-posterior akse af BF, udløser en differentieret udtryk for proteiner ændres i Annoncen, som den alpha7 nicotinsyre receptoren (α7-nAChR), fosforyleret Tau (p-Tau) og amyloid beta (Aβ).
Introduction
Annonce er en kronisk patologi karakteriseret ved gradvis neurodegenerative værdiforringelse påvirker forskellige hjernen områder, såsom entorhinal cortex (EF), BF, hippocampus (HC) og olfaktoriske pære (OB)1,2,3, 4,5. De sene stadier af annonce udvikling føre til en progressiv kognitiv tilbagegang, gør denne sygdom den mest almindelige form for demens, ca tegner sig for 70% af alle tilfælde6. Trods omfattende forsøg på at forstå de indledende faser forårsager annonce, er der ikke i øjeblikket en defineret eksperimentelle indikation belyse dem. Desuden de mest populære teori – den “amyloid hypotese” – er i stigende grad spørgsmålstegn ved da det ikke giver en komplet profil i forklare AD pathobiology, og heller ikke et farmaceutisk mål, der har vist sig effektiv7,8 ,9.
En alternativ teori, som får stigende opmærksomhed tyder på, at de oprindelige mekanismer opstår under neurodegeneration er relateret til en neuronal klynge primært modtagelige i AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. denne heterogene cellulære hub omfattede i BF, midthjernen og hjernestammen, projekter til flere regioner, som EF, HC og OB15,16. Trods sin mangfoldighed i neuronal morfologi og neurotransmitter syntese deler denne kerne af cellerne et fælles træk i at udtrykke smerte, som også kan have en ikke-enzymatisk funktion17,18. Denne ikke-klassisk rolle som en roman, signalering molekyle medierer calcium (Ca2 +) flow til neuroner, som kan gennemgå trofiske eller toksiske hændelser i forbindelse med Ca2 + dosis, tilgængelighed og neuronal alder17,18 , 19.
Under neurodegeneration, kan den observerede cellulære tab knyttes derfor til denne ikke-enzymatisk funktion17,18,20, der tilskrives en 30mer peptid (T30) kløvet fra AChE C-terminus 20. i overensstemmelse med tidligere resultater, foretaget på cellekultur og optiske billeddannelse18,21 præparater, vi viste, gennem en ny tilgang baseret på ex vivo rotte hjernen skiver indeholdende BF strukturer, der T30 induceret en annonce-lignende profil22. Specifikt, tilbyder denne nye metode en mere fysiologisk scenario end cellekultur, da det har bevaret mange af egenskaber ved en intakt væv, lige fra anatomiske til kredsløb bevarelse, omend til et tidsvindue på timer. Vi anvendte denne protokol for at udforske de begivenheder, der finder sted i de tidlige faser af neurodegeneration, overvågning af den akutte reaktion efter T30 ansøgning.
Trods den store krop af litteratur om brug af hjernen skiver at undersøge molekylære veje underforstået i neuronal skade eller neurogenese23,24, denne protokol giver for første gang en mere umiddelbar og følsomme oplæste sammenlignet til fælles brug af organotypic skiver. Men, som er tilfældet for organotypic hjernen sektioner, denne akut skive procedure kan også vedtages til flere formål, såsom evaluering af neuroprotektive eller neurotoksiske molekyler, opdagelsen af primære molekylære forandringer i en bestemt proces, immunhistokemisk analyse og farmakologiske assays til centralnervesystemet relateret patologier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det vigtigste aspekt af denne protokol, baseret på den veletablerede ex vivo hjerne teknik, gør det muligt for at teste synkront to spektakulære hemislices, fremstillet af den samme anatomiske fly, overvåge deres svar efter anvendelsen af en bestemt betingelse (styre eller behandlet); Dette giver derfor en eksperimentel paradigme så stramt kontrolleret som muligt. Mulighed for at vurdere i en tid-, dosis- og områdespecifikke måde forskellige neurochemicals relateret til neuronal værdiforringelse, som set…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Neuro-Bio Ltd. Vi vil gerne takke Dr. Giovanni Ferrati og Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) for deres kommentarer og råd om håndskriftet.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). 신경과학. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
