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암 연구학

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57500
,
1Experimental Dermatology, Medical Faculty,TU-Dresden

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Abstract

Transformación maligna de los melanocitos, las células del pigmento de la piel humana, provoca la formación del melanoma, un cáncer muy agresivo con mayor potencial metastásico. Recientemente, mono quimioterapia continúa mejorando por terapias de combinación específica de melanoma con inhibidores de la quinasa específica. Todavía, melanoma metastásico sigue siendo una enfermedad mortal porque tumores exhiben resistencia primaria o desarrollan resistencia a nuevas terapias, así recuperando capacidad tumorigénica. Para mejorar el éxito terapéutico del melanoma maligno, la determinación de los mecanismos moleculares que confieren resistencia a tratamientos convencionales es necesaria; sin embargo, requiere modelos innovadores celulares en vitro . Aquí, presentamos un en vitro tridimensional (3D) organotypic esferoide modelo de melanoma que puede retratar la arquitectura en vivo de melanoma maligno y puede justificar nuevas penetraciones en intra tumoral así como de las interacciones del tumor-host. El modelo incorpora números definidos de esferoides de melanoma maduro y diferenciado en un modelo de reconstrucción llena de la piel humano 3D consisten en células primarias de la piel. El estado de diferenciación y composición celular de los esferoides de melanoma incrustado es similar a la de metástasis de melanoma cutáneo en vivo. Utilizando este modelo de esferoide organotypic melanoma como una droga de investigación plataforma puede apoyar la identificación de respondedores a seleccionado tratamientos combinados, mientras que ahorra la carga de tratamiento innecesario para los no respondedores, aumentando así el beneficio de intervenciones terapéuticas.

Introduction

La piel humana se compone de dos compartimentos distintos que sirven a diferentes funciones de proteger el cuerpo contra los efectos ambientales adversos1. El compartimiento cutáneo inferior consta de un fibro-elástica del tejido conectivo. Se compone de fibras de colágeno y elastina libremente conectadas sintetizadas por fibroblastos, sirviendo una función de barrera mecánica. La dermis está separada de la epidermis superior de la lámina basal que se produce como una matriz extracelular debido a una comunicación constante entre ambos compartimientos de la piel. A diferencia de la dermis, la epidermis es un epitelio escamoso que se compone principalmente de queratinocitos y pueden diferenciarse en cuatro capas. Consiste en el estrato basal de queratinocitos basales indiferenciadas que constantemente derivan de células progenitoras de piel estratificación a través de las etapas del estrato espinoso y estrato granuloso en el corneum del estrato para proteger el cuerpo contra deshidratación e infecciones2. Melanocitos se alinean en la membrana basal y comunican a través de extensiones dendríticas con múltiples queratinocitos. Que producen la melanina de pigmento para proteger el tejido de la piel de los efectos adversos de la radiación UV, como el envejecimiento de la piel, inmunosupresión, inflamación e inducción de cáncer de piel no melanoma. Aporte de radiaciones UV para la transformación de los melanocitos en melanoma maligno, sin embargo, está aún bajo debate3.

Desarrollo de melanoma es diferenciado en etapas de progresión del tumor diferentes y se caracteriza por ciertos cambios genéticos, morfológicos y histologic4. Se originan ya sea de novo o de un nevo innato o adquirido debido a un local aumento de proliferación de melanocitos causando neoplasia benigna. Esta lesión precursora se puede convertir en tejido displásico estructuralmente modificado que contienen células atípica, que pueden seguir a la primera etapa mala, la fase de crecimiento radial (RGP). Esta fase temprana de la progresión de tumor se caracteriza por células proliferando radialmente dentro de la epidermis, que muestra pocas células localmente invasoras dentro de la dermis papilar. En el melanoma de fase (VGP) crecimiento vertical posterior las células ya muestran un fenotipo invasivo y metastático rompiéndose a través de la lámina basal para infiltrarse en las partes más profundas de la dermis y el tejido subcutáneo5. Por último, el melanoma metastásico (MM) representa la etapa de progresión más agresiva con las células metastásicas separarse sistémicamente a través del sistema sanguíneo y linfático distal invadir órganos como hígado, pulmón y cerebro6.

Hasta la fecha, el diagnóstico precoz seguido de cirugía sigue siendo el tratamiento más eficaz del melanoma malo. El pronóstico para los pacientes con metástasis a distancia, sin embargo, sigue siendo particularmente pobres7, porque los regímenes de quimioterapia clásica confieren sólo poca supervivencia beneficio8,9. Sin embargo, después de décadas de estancamiento, los recientes avances en terapias dirigidas han mejorado considerablemente el pronóstico del melanoma maligno.

Dysregulation de dos vías principales mitógeno activada, RAS-RAF-MEK-ERK y las vías de señalización de PI3K-AKT-PTEN, presentan motores clave de la progresión del melanoma, especialmente cuando está constitutivamente activando mutaciones puntuales de los proto-oncogenes BRAFV600 y ANR están presentes10. En consecuencia, la invención de los inhibidores de la quinasa específica prometió beneficios terapéuticos para pacientes con melanoma metastásico. Una multitud de ensayos clínicos realizados a este punto no ha logrado un beneficio significativo para los pacientes con melanoma metastásico. Casi todas las respuestas son parciales, con una subpoblación de pacientes que muestran resistencia primaria. Por otra parte, la adquisición de resistencia secundaria, conduce a la recidiva se observó en la mayoría de los pacientes11,12.

Queda claro que análisis de la situación de mutación solamente no son suficiente para desarrollar la estrategia terapéutica más potente. Nuevas herramientas de diagnóstico rápidos y fiables son necesarias para registrar y analizar la capacidad de respuesta de las células cancerosas individuales sistemáticamente. La gran mayoría de los datos actualmente disponibles en melanoma humano ha sido obtenida de cultivos celulares de dos dimensiones (2D) melanoma. Las células del tumor, sin embargo, crecidas en 3D permiten interferencia intercelular entre cáncer diferenciado subpoblaciones celulares así como entre las células cancerosas y el tejido circundante host no transformado. Por lo tanto, lo mejor sería reconstruir el entorno 3D en el que el melanoma desarrollado para ser utilizado como una investigación preclínica modelo13,14.

Protocol

Todos los trabajos de tejido humano se realizan mediante protocolos institucionales aprobados. 1. separación de la Dermis y la Epidermis de la piel humana (prepucio juvenil de la circuncisión) Colocar el prepucio (generalmente 1-2 cm2) en una placa de cultivo celular estéril no adhesiva (Ø 10 cm) y cubrirla con 10-12 mL de solución salina con tampón fosfato+ (PBS, pH 7.2, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2= PBS+). Retire todo exceso de tejido (adiposo) uso pinzas y bisturí estéril. Cortar la piel en trozos de 3 x 5 mm, lavar con PBS y transferirlas a una placa de cultivo celular estéril no adhesiva (Ø 6 cm). Cubrir las piezas de tejido con 5-7 mL de solución dispase (2 U/mL en PBS). Sellar la placa de cultivo celular con la película de parafina e incube por 16 h a 4 ° C. Repliegue de la epidermis de la parte dérmica con dos pinzas estériles. Transferir las piezas diseca el tejido a los platos de la cultura de célula individual no adhesiva (Ø 6 cm) y cubra cada uno con PBS+. 2. aislamiento de queratinocitos primarios de la Epidermis Con cuidado retire el PBS+ de la placa de cultivo de células utilizando una pipeta Pasteur y lave las piezas de tejido epidérmico (sección 1.3) con PBS. Corte de la epidermis en trozos más pequeños (1 mm2) y recoger en un tubo cónico de 50 mL. Añadir 10 mL 1 x tripsina-EDTA (precalentado a 37 ° C) e incubar por 5 min en un baño de agua a 37 ° C. Vórtice de la suspensión de tejido cada 2 minutos. Detener la reacción enzimática añadiendo 1 mL de suero de ternero fetal (FCS). Resuspender las células por arriba y abajo el pipeteo con una pipeta de plástico de 10 mL para 4 minutos tratar de evitar las burbujas y la formación de espuma. Pipetear la suspensión celular en un colador de célula (poro tamaño 100 μm), colocado encima de un tubo cónico de 50 mL fresco y enjuagar 3 veces con 5 mL de PBS. Centrifugar las células a 200 x g por 5 min Resuspender el precipitado de células en 2-6 mL medio de cultivo que contiene gentamicina 1% (v/v). Determinar el número de células manualmente por contar las células en un hemocitómetro y semilla 6 x 105 células en un frasco de cultivo celular T75. 3. cultivo de queratinocitos primarios Incubar los queratinocitos primarios aislados en el paso 2.3 en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO2 en medio de queratinocitos sin FCS, a 50-70% de confluencia. Al paso de los queratinocitos con cuidado quitarlo del medio, añadir 5 mL de PBS-EDTA e incube las células durante 10 min a 37 ° C. Comprobar si las células han comenzado a separar del frasco de cultivo bajo un microscopio de luz (4 aumentos: las células aparecerán redondeadas pero todavía están conectadas!). Si no, sustituir viejos PBS-EDTA con PBS-EDTA fresco y volver a incubar durante otros 10 minutos a 37 ° C. Añadir 5 mL 1 x tripsina-EDTA a las células redondeadas aún cubiertos con 10 mL de PBS-EDTA y volver a los Incube por 1-3 min a 37 ° C. Detener la reacción enzimática añadiendo 1 mL FCS y recoger las células separadas en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min, Resuspender el precipitado en medio del keratinocyte y semilla 6 x 105 células en un frasco de cultura de célula T75 fresco.Nota: Para generar organotypic piel reconstruye, los queratinocitos primarios deben utilizar no más adelante que paso 3-4. 4. aislamiento de fibroblastos primarios de la Dermis Cortar el tejido cutáneo (sección 1.3) en trozos más pequeños (1 mm2) y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Añadir 10 mL solución de colagenasa (5 U/mL en PBS+) e incubar durante 45 min en un baño de agua a 37 ° C. Centrifugar la mezcla de piezas de tejido y células a 200 x g durante 5 minutos. Lavar el precipitado de células dos veces con 10 mL DMEM que contiene 4,5 g/L glucosa y L-glutamina, pero sin L-piruvato. Finalmente resuspender las piezas de tejido en 2 mL de DMEM que contiene gentamicina 1% (v/v) y 10% FCS. Transferir a un matraz de cultivo celular T25 e incubar en una incubadora de la célula a 37 ° C y 5% de CO2 durante la noche.Nota: El escaso volumen permite a los fibroblastos migrar de los restos de tejido y los obliga a colocar en el matraz de la cultura. A la mañana siguiente, añadir otros 6 mL DMEM/gentamicina/FCS e incubar durante 2-3 días a 37 ° C hasta que las células hayan alcanzado el 80-90% de confluencia. 5. cultivo de fibroblastos primarios Paso de los fibroblastos, quitarlo del medio y lavar las células adherentes con PBS. Añadir 5 mL 1 x tripsina-EDTA e incubar 3 min a 37 ° C. Detener la reacción enzimática añadiendo 5 mL DMEM/FCS y recoger las células separadas en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min, Resuspender el precipitado en medio DMEM y 6 x 105 células de la semilla en un frasco de cultura de célula T75 fresco.Nota: Para generar organotypic piel reconstruye, los fibroblastos primarios deben utilizar no más adelante que paso 4-6. 6. generación de Melanoma 3D esferoides mediante el método de la gota colgante Cultura las células del melanoma (p. ej., 451-LU o cualquier línea celular de melanoma de interés) según protocolos generales, con RPMI con 10% FCS15. Para generar esferoides de melanoma de tamaño y calidad similares, lave las células de melanoma en PBS, añadir 5 mL de 1 x de tripsina-EDTA en PBS a las células en un T175 matraz de cultivo de células e incubar durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT). Neutralizar la tripsina añadiendo 5 mL RPMI/10% FCS. Cosecha de que las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min Resuspenda el precipitado de células en RPMI/FCS a una concentración final de 10.000 células/mL, determinado por el recuento en un hemocitómetro. Punto 40 x 25 μl (= 250 células) de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo estéril no adhesivo celular (Ø 10 cm) con una pipeta múltiple electrónica. Con un movimiento rápido pero suave, vuelta la tapa y coloque en el plato de cultura de célula respectiva que contiene 5 mL de PBS. Cultura “platos de gota colgante” en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO2 por 10-14 días, dependiendo del tipo de célula utilizada.Nota: Las células de la fase de crecimiento MM típicamente crecen más rápido y forman esferoides más sólidos en la gota de la suspensión en comparación con las células del melanoma se deriva de la RGP o VGP. Para la evaluación individual, observar crecimiento de esferoide bajo un par de binoculares o un microscopio óptico (4 aumentos). Esferoides se convierten generalmente detectables después de 48 h en un par de binoculares o un microscopio óptico (4 aumentos). Después de 10-14 días, son visibles sin ningún dispositivo de aumento. 5 días después de la caída inicial manchado, añadir 10 μl de medio fresco de RPMI/10% FCS a cada gota. Posteriormente, intercambiar 10 μl de medio día. El uso de un dispensador electrónico es muy útil en este paso. Dependiendo del tipo de célula, de la cosecha los esferoides (ver sección 10 para más detalles) después de 10-15 días enjuagándolas suavemente de la tapa de plato de cultura de célula con PBS. Recogerlos en una placa de cultivo celular no adhesivo fresco.Nota: El período de cultivo depende de la fase de crecimiento del tumor de las células del melanoma cuando que inicialmente fueron derivados, por ejemplo, esferoides, derivados de células 451-LU crecen aproximadamente 500 μm de diámetro dentro de 12 días de cultivo en la gota colgante15 . 7. generación del compartimiento cutáneo de piel completo Organotypic reconstruye Generar modelos de piel mediante célula de 24 pocillos microporosa membrana insertos (tamaño 8 μm de poro) en placas de 24 pocillos.Nota: Asegúrese de no utilizar colgantes pero insertos, porque colocaron en una placa de 6 pozos de aire-líquido de cultivo en una etapa posterior. Preparar el gel neutralización solución (GNL)15, así como los medios de cultivo denominados m y crecimiento endotelial de16,de medios (EGM)17. Para prevenir la coagulación, tienda el colágeno tipo I (generalmente de cola de rata, 3.5-4 mg/mL en 0.02 N de ácido acético) en hielo hasta su uso, ya que se inicia al gel a TA. Vuelva a suspender 1 x 105 fibroblastos por insertar en GNL y rápidamente mezclar la suspensión de células con el colágeno en una proporción de 1:3 en un volumen final de 500 μl/insertar. Mezclar mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar formación de burbujas, las burbujas pueden perjudicar la calidad de la piel reconstruir. Permita que los geles cutáneos individuales resolver por mantenerlos sin medio a temperatura ambiente por 30 min en una capucha estéril. Posteriormente cubrir el gel con DMEM que contenía glucosa 4,5 g/L, de 1% L-glutamina, 10% FCS y sin L-piruvato e incubar toda la noche a 37 ° C. 8. generación del compartimiento epidérmico de piel completo Organotypic reconstruye Al día siguiente Retire el medio de los geles cutáneos y equilibrar con medios EGM (10% FCS, 1% PenStrep, gentamicina 10 mg/mL) durante 2 h a 37 ° C. Retirar el medio y con cuidado la semilla 1 x 105 queratinocitos resuspendió en 100 μl de EGM en la parte superior del gel dérmico. Incubar la reconstruye durante 1,5 h a 37 ° C para permitir que los queratinocitos se adhieran al compartimiento cutáneo.Nota: Durante este tiempo de incubación, los geles comenzará a reducir debido a la contracción inducida por el fibroblasto y así, al menos parcialmente se desprenda de las paredes del inserto. Cubrir los equivalentes de piel con aproximadamente 800 μl de EGM y retire con cuidado el gel residual de la pared del parte movible con una pequeña pipeta (blanco). Los equivalentes de piel sumergidos en EGM para 7 días en una incubadora de la célula a 37 ° C, 5% CO2, de la cultura y cambiar el medio día.Nota: Durante este tiempo los equivalentes de piel se reducirá significativamente. 9. aire-líquido cultivo de piel Organotypic completa reconstruye Día 8 traslado cada Inserte un pozo individual de una placa de 6 pozos. Sólo añadir 1.2-1.4 mL de medio m a cada pozo, para que la piel reconstruir se suministra con medio de la parte inferior del pozo pero no está cubierto con medio.Nota: Cultivo en la interfase aire-líquido permite la estratificación de la parte epidérmica y el establecimiento de una completa capa cornified (estrato córneo). Durante los próximos días 10-17, cambiar el medio como se indica en la sección 9,1 cada día. Durante este período, añadir drogas u otros estímulos como sea necesario para el medio. Retire con cuidado el reconstruir de piel completo del compartimento de membrana microporosa con unas pinzas curvas para su posterior análisis, por ejemplo, el análisis de immunohistochemical (figura 1). 10. generación de los modelos de piel Organotypic Melanoma esferoide Para integrar los esferoides de melanoma en el compartimiento cutáneo de la reconstruye de organotypic llena de la piel, enjuagar cuidadosamente los esferoides (después paso 6.4) de la tapa de las que cuelgan gota placa de cultivo de células con PBS. Recoger 10-20 esferoides/insertar en una placa de cultivo estéril no adhesivo celular. Retire con cuidado excesivo PBS con una pipeta Pasteur. Aspire los esferoides en el posible más pequeño del volumen de EGM. En este punto observar y contar los esferoides con el ojo desnudo, sin ningún otro dispositivo de aumento. Tomar 10-20 esferoides por modelo/gel de la piel, como se indica en el paso 10.1. Transferencia para el volumen de GNL que contiene fibroblastos (durante el paso 7.3) y mezclar con el colágeno de tipo I. De este paso en proceder como se describe en las secciones 7.3 9.1.Nota: Esferoides tumorales se hacen visibles en el gel cutáneo como manchas blancas (figura 2)

Representative Results

Tratamiento acertado de la metástasis de melanoma puede verse afectado por la interferencia entre las células del tumor, así como entre tumor y las células del huésped no transformado. El propósito de desarrollar modelos organotypic de cáncer en vitro es proporcionar sistemas de test preclínicos adecuados que recapitulan la organización 3D y la complejidad de melanoma humano en vivo. Esto permite el estudio de los efectos terapéuticos sobre el tumor dentro de un entorno organotypic y los efectos adversos sobre el tejido circundante primario en paralelo. Para desarrollar los mejores modelos de piel organotypic, reviste la calidad de las células primarias. Es ventajoso utilizar juveniles primarios fibroblastos y queratinocitos, porque por lo general menos se diferencian en comparación con las células epiteliales primarias adultos. Juvenil piel células pueden ya sea aislarse de prepucio juvenil como se describe en las secciones del protocolo 1-5, pero también pueden adquirirse en empresas como queratinocitos y los fibroblastos primarios pre-natales. Si compras, es necesario a las células del orden de diferentes donantes para evitar resultados específicos del donante, por ejemplo, para la sensibilidad de la droga. El protocolo entero aparece como un esquema en la figura 3. Control de calidad de equivalentes de piel completo 3D requiere el análisis de immunohistochemical. Una primera impresión puede obtenerse de la Hematoxylin-eosina (H & E) manchas de parafina incorporado secciones (3 μm). Análisis detallado de la calidad de la diferenciación epidérmica y formación de la lámina basal entre el dermis y la epidermis requieren el análisis de immunohistochemical usando los anticuerpos específicos contra un marcador de estratificación epidérmico. Esto permite distinguir entre las células no diferenciadas, altamente proliferativas situado cerca de la membrana basal y altamente diferenciados y queratinizado células en el estrato córneo a través de la formación de diferentes capas epidérmicas entre . Como se muestra por la coloración histológica inmune (figura 4), diferenciación de los queratinocitos en la epidermis puede lograrse similar a la piel normal: principalmente las células indiferenciadas de las capas inferiores de la epidermis (estrato basal y spinosum del estrato) tinción positiva para la queratina 14, mientras que las células más diferenciadas de las capas supra basal (estrato granuloso y estrato córneo) tinción positiva para la queratina 10 y involucrin. Por consiguiente, filaggrin tinción sólo se pudo observar en las células altamente diferenciadas del corneum del estrato. Lo más importante, laminina 5 tinción revela que una lámina basal fue generada para conectar fisiológicamente el epidérmico del compartimiento cutáneo de la piel artificial reconstruir. Esto demuestra que se ha generado un microambiente organotypic comunican a las células del melanoma host o esferoides para análisis fisiológico y patofisiológico. Con el fin de detección de drogas de melanoma, células de melanoma solo pueden integrarse también en la dermis de los equivalentes de piel completo para permitir de nuevo melanoma nido formación18,19. Por lo tanto, las células del melanoma se combinan con fibroblastos primarios en una proporción de 5:1, centrifugada a 200 x g durante 5 minutos y resuspendió en GNL antes de mezclarse con el colágeno. Como resultado, los nidos de células de melanoma espontáneamente se forman en el compartimiento cutáneo. Según nuestra experiencia, sólo las células del crecimiento metastático fase nidos adecuada forma, en comparación con las células del melanoma de la RGP o VGP15. Un gran inconveniente de este tipo de modelos es el hecho de que el número y tamaño de nidos de melanoma formado no se puede predecir y varían entre individual piel reconstruye, independientemente de cualquier tratamiento. Por ejemplo, 1.000 células sembradas en el compartimiento cutáneo pueden ganar 10 nidos de 100 células o 100 nidos que consta de 10 células cada uno (figura 5). Estas variables biológicas presentan tres deficiencias: en primer lugar, el número y tamaño de melanoma nidos formados son impredecibles; en segundo lugar, la metástasis en vivo son generalmente más grandes que nidos de melanoma y exhiben una diversidad intra tumoral más compleja; y en tercer lugar, debido a la limitada vida de modelos de tumor-nido, tratamiento se inicia temprano y por lo tanto algo inhibe la extensión del tumor en lugar de causar la regresión de los nidos tumorales. Para superar estos limitaciones organotypic melanoma esferoide piel los modelos puede ser generados. Por melanoma metastásico 250 cultivo células en una suspensión de la gota para días 1420, esferoides se generan reproducible de melanoma viable las células que presentan una estructura compacta con un diámetro final de aproximadamente 500 μm mímico no vascularizadas nodos, micro metástasis, o entre capilar micro regiones del tumor tumores sólidos21,22. En general, cualquier línea celular de melanoma es adecuado para la generación de esferoides mediante el colgante gota método; sin embargo, células derivadas de la más avanzada forma de tumor metastático etapas esferoides más sólidas frente a líneas celulares derivadas de progresión las etapas iniciales, por ejemplo, la RGP. Para algunas células, es ventajoso para la formación del esferoide adecuada mejorar la viscosidad de la suspensión la gota de medio de cultivo. Esto puede lograrse mediante la adición de 10-50% metil-celulosa al medio de cultivo. Para la solución madre de metil-celulosa, autoclave 1.2 g metil-celulosa, junto con una barra de agitación magnética en una botella de vidrio de 100 mL. Añadir 100 mL precalentado (60 ° C) medio y revuelva durante 20 min a temperatura ambiente y otro 1-2 h a 4 ° C. Centrifugue la solución por 2 h a 5.000 x g y guarde el sobrenadante viscoso a 4 ° C hasta su uso. Correcta validación de modelos de esferoide de melanoma de piel completo es proporcionado por el hecho de que un número definido de melanoma esferoides pueden – por lo menos estadísticamente – integrarse en el colágeno del fibroblasto dérmico andamio en el día 1 de la construcción de modelo de piel, lo que permite les a desarrollar durante la diferenciación epidérmica por 25-27 días. El rendimiento de esferoides puede ser analizado directamente después de la siembra, porque esferoides aparecen como manchas blancas dentro de la transparencia cutáneas gel y pueden ser vistos sin ningún dispositivo de aumento (figura 2). Como resultado, se genera un modelo 3D de la piel que esferoides de melanoma maduro de puertos, que habían sido cultivado en vitro para un total de aproximadamente 42 días, que muestra el nivel más alto de intra tumoral celular diferenciación15. H & E tinción del modelo de esferoide de melanoma de piel revela el aspecto histológico y la distribución celular de esferoides de melanoma muy similar a del melanoma humano no vascularizada piel metástasis en vivo15 (figura 6 ). Dos subpoblaciones de células de melanoma son claramente distinguibles en esas condiciones: una subpoblación proliferación periférica y una subpoblación central consistiendo en principalmente encogido, apoptóticas o necróticas células, formando el supuesto “necrótico” Centro. Immunohistochemically, viven y proliferan las subpoblaciones se puede detectar usando los anticuerpos contra el marcador de proliferación KI-67, mientras que las células del centro necrótico se pueden visualizar por tinción TUNEL15. Esta particular distribución de las subpoblaciones de células de tumor está garantizada por el tamaño del esferoide (≥500 μm), resultante de una falta de nutrientes y oxígeno en la parte central donde se acumulan residuos catabólicos. Siguiendo el protocolo proporcionado aquí permitirá la generación de un confiable y reproducible organotypic modelo de piel humana de espesor completo con había incrustado esferoides de melanoma humano que mímico metástasis del melanoma humano piel. Aplicaciones de este modelo incluyen las pruebas de drogas, detección de toxinas, la influencia de compuestos cosméticos o terapia en consecuencia de melanoma y el tratamiento con láser. Figura 1 : Cultivo de organotypic 3D piel reconstruye sumergido con medio y en la interfase aire-líquido. En el día 0 queratinocitos primarios se siembran en la parte superior del compartimiento cutáneo compuesto por fibroblastos primarios encaja en un tipo de colágeno I matriz. Piel 3D reconstruye permanecer cultivada sumergido con EGM durante 7 días, separarlo de la pared del parte movible y empezar a encogerse. En el día 8 los insertos son transferidos a 6 pozos y cultivados en la interfase aire-líquido para permitir la estratificación epidérmico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Esferoides de melanoma encajados el compartimiento cutáneo aparecen como manchas blancas. Mientras preparar el compartimiento cutáneo de la reconstruir piel 3D, un número definido de esferoides de melanoma puede añadirse el tipo de colágeno del fibroblasto que mezclar. Una vez que ha colocado el gel cutáneo, esferoides de melanoma se hacen visibles como manchas blancas. Figura 3 : Esquema de la construcción del modelo 3D organotypic piel. Eliminar el tejido adiposo de la muestra de la piel y cortarlo en trozos más pequeños. Incubación con solución dispase durante la noche a 4 º C facilita la separación de la epidermis de la dermis. Queratinocitos y los fibroblastos primarios aislados deben ser cultivado por separado y utilizado entre paso 4-6 y 3-4, respectivamente. Posteriormente, la generación del modelo 3D de la piel puede proceder como se describe en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : 3D organotypic piel reconstruye muestra un nivel de diferenciación similar a la piel humana normal. Secciones de los equivalentes de piel de parafina (A) piel humana comparada con normales (B) fueron manchadas para la expresión de queratinas 14 (rojo: λex 554 nm; λem 568 nm) y involucrin 10, (verde: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (verde: λex 490 nm; λem 525 nanómetro) y laminina 5 (verde: λex 490 nm; λem 525 nanómetro) y se analizaron con un microscopio de fluorescencia confocal. Los núcleos de célula fueron visualizados por tinción DAPI (azul: λex 340 nm; λem 488 nm). Examinación de Immunohistochemical del 3D full grueso de piel equivalentes reveló apropiada epidérmico estratificación formando distintas capas de la epidermis en piel humana normal. Mientras que las células de las capas epidérmicas inferiores mancharon el positivas para la queratina 14, más células diferenciadas de la capa basal supra demostrada queratina 10 y la coloración de involucrin. Las células altamente diferenciadas cerca del estrato córneo expresan filaggrin. Laminin 5 tinción muestra que se genera una lámina basal para conectar fisiológicamente el epidérmico del compartimiento cutáneo (panel inferior). Esta figura ha sido tomada de Voersmann et al. 15 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : No se puede predecir el número y tamaño de los nidos de melanoma espontáneamente formados. Formación de nido de melanoma de novo en el compartimiento cutáneo de piel completo equivalentes se logra mezclando un número definido de melanoma células con fibroblastos primarios para incorporar ambos tipos de células en el colágeno de tipo I matriz. El número y tamaño de los nidos de melanoma espontáneamente formados pueden ser analizadas sólo desde un reconstruir piel 3D madura después de 21 días. Como se muestra de dos muestras (A) y (B), los números y los tamaños de los nidos de melanoma pueden variar entre reconstruye la piel individual. En consecuencia, es difícil validar estos modelos y para predecir el impacto terapéutico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6 : Esferoides de melanoma integrados en equivalentes de piel recapitulan las características clave de la metástasis de melanoma cutáneo humano. H & E tinción de secciones de la parafina de esferoides tumorales embebidos en equivalentes de piel revelaron esferoides que comparte características clave con las metástasis de melanoma cutáneo humano no vascularizado en vivo. Dos subpoblaciones de células son claramente discernibles: una subpoblación de vida periférica y central subpoblación que consiste en principalmente encogido, apoptóticas o necróticas células, formando el centro “necrótico”. Esta distribución de las subpoblaciones de células de tumor está garantizada por el tamaño del esferoide. Esta figura ha sido modificada de Voersmann et al. 15 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Organotypic melanoma esferoide piel modelo introducido aquí garantiza nuevas perspectivas para una comprensión más profunda de intra tumoral y la interacción del tumor-host y puede proporcionar una plataforma de investigación avanzados para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo del tumor y resistencia de la terapia en el futuro.

Para garantizar el mejor fisiológica y reconstruye en vivo imitando las condiciones de la piel, la calidad de las células primarias es de suma importancia. Como se indicó anteriormente, las células de la piel juvenil o prenatal muestran el menor grado de diferenciación y por lo tanto son más adecuadas generar equivalentes de piel de grosor total. El primer posible control de calidad es el grado de contracción cutánea en el día 2 después de la siembra de los queratinocitos y equilibrando el gel a EGM (secciones 8.2 y 8.3 del Protocolo). Geles cutáneos reducirá al máximo con la mejor calidad de los fibroblastos. Además, la integración de los fibroblastos muy pocos o demasiados puede perjudicar la contracción cutánea y por consiguiente fijación de la epidermis del compartimiento cutáneo. Esto a su vez afectarán la diferenciación epidérmica, ya que este proceso requiere una extensa Charla cruzada entre las células dérmicas y epidérmicas.

La calidad de células primarias también críticamente depende de la confluencia celular así como el paso de las células. Si keratinocytes cultivados a ≥80% confluencia inmediatamente detener la proliferación y empezar a distinguir. Por lo tanto es importante a la cultura les a confluencia de 40-70% en pases y utilizar no más adelante que paso 3-4. Los fibroblastos son menos sensibles pero no deben ser utilizados más adelante que paso 4-6. Tenga en cuenta que todas las células primarias y líneas celulares utilizadas para generar modelos de piel organotypic melanoma esferoide se cultivan libres de antibióticos, y por lo tanto el riesgo de contaminación es alto. Sin embargo, la adición de antibióticos cambia la fisiología de las células individuales y por lo tanto reduce la calidad de los equivalentes de piel.

En general, formación esferoide del tumor es posible de casi todo tipo de líneas celulares tumorales y de células tumorales recién aisladas de paciente material. El tiempo inicial de la célula número o cultivo para obtener tamaños de esferoide óptima puede variar dependiendo del tipo de célula utilizado. Hasta un tamaño de 150-200 μm, todas las celdas incluidas en un esferoide pueden todavía ser suficientemente provistas de nutrientes por difusión simple. Sólo esferoides con tamaños ≥500 μm muestran un alto grado de diferenciación celular y representan características típicas del tumor no vascularizado tejido22.

El organotypic melanoma-esferoide-piel-modelo desarrollado aquí es particularmente conveniente para el estudio de las interacciones del tumor-host y fármaco melanoma pruebas en vivo-como condiciones15. Aún así, el ambiente de melanoma en vivo es aún más complejo, que alberga una gran variedad de tipos de células de tumor asociado, incluyendo las células inmunes y células endoteliales. Puesto que la adición de células inmunes primarias apropiadas enfrenta problemas de histocompatibilidad, estos modelos no son aún capaces de controlar adecuadamente enfoques terapéuticos inmune.

Sin embargo, esferoides de melanoma pueden generarse material paciente recién aislado y una vez incluido en el reconstruir de piel completo, puede servir como medicamento individual investigación plataformas. Incluso la integración de piezas de metástasis de melanoma en piel reconstruye es concebible para probar combinaciones de fármacos en un acercamiento terapéutico a la medida. Incluyendo el modelo 3D de piel-melanoma organotypic en ensayos preclínicos es probable ayudar a asegurar que sólo los más prometedores nuevos conceptos terapéuticos llevan adelante en ensayos clínicos, reduciendo así la tasa de deserción de potenciales nuevos tratamientos para esto enfermedad y aumentar la tasa de éxito terapéutico en los ensayos clínicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Hanna Voersmann para establecer el 3D organotypic melanoma-esferoide-piel-modelo y protocolos excelentes. Los autores también agradecen a Silke Busch por valioso apoyo técnico. El trabajo fue apoyado por BMBF e: programa Med 031A423A “Sensibilidad del Melanoma”.

Materials

fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100
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References

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Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).
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