3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

모든 인간의 조직 작업 승인된 기관 프로토콜을 사용 하 여 수행 되었다. 1. 인간의 피부 (할례에서 청소년 포 피)에서 진 피와 표 피의 분리 비 접착식 멸 균 셀 문화 접시 (Ø 10 c m)으로 포 피 (보통 1-2 cm2)를 놓고 염 인산 염 버퍼+ 의 10-12 mL와 함께 그것을 커버 (PBS, 0.5 m m MgCl2, 0.9 m m CaCl2, pH 7.2 PBS+=). 모든 초과 (지방) 조직 살 균 메스와 집게를 사용 하 여 제거 합니다. 3 m m x 5 m m 조각으로 피부를 잘라, PBS와 그들을 세척 하 고 비 접착식 멸 균 셀 문화 접시 (Ø 6 cm)에 그들을 전송. 5-7 mL dispase 솔루션 (PBS에 2 U/mL)의 조직 조각을 커버. 파라핀 영화와 셀 문화 접시 및 4 ° c.에 16 h에 대 한 품 어 두 살 균 겸 함께 상피 피부 부분에서 철회. 개별 비 접착제 셀 문화 요리 (Ø 6 cm) 해 부 조직 조각을 전송 하 고 PBS+를 가진 그들의 각각을 커버. 2. 표 피에서 기본 Keratinocytes의 격리 조심 스럽게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 접시에서 PBS+ 를 제거 하 고 씻어 PBS와 표 피 조직을 조각 (섹션 1.3). 작은 조각 (1 m m2)으로 표 피를 잘라내어 50 mL 원뿔 튜브에 수집. 10 mL 1 추가 트립 신-EDTA (37 ° C에 미리 데워) x 37 ° c.에 물 욕조에 5 분 동안 품 어와 와 동 조직의 서 스 펜 션 마다 2 분입니다. 1 mL 송아지 태아 혈 청 (FCS)를 추가 하 여 효소 반응을 중지 합니다. 4 분 거품을 피하기 위해 거품 형성을 시도 대 한 10 mL 플라스틱 피 펫으로 아래로 pipetting으로 세포를 resuspend. 피펫으로 세포 현 탁 액 셀 스 트레이너 (기 공 크기는 100 µ m)에 신선한 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓이고 5 mL PBS와 함께 3 x 린스. 5 분 Resuspend 셀 펠 릿 1% (v/v) gentamycin을 포함 하는 2-6 mL 문화 매체에 대 한 200 x g에서 세포를 원심. T75 셀 문화 플라스 크로 수동으로 hemocytometer 및 씨앗 6 x 105 셀에 계산 셀에 의해 셀 수를 결정 합니다. 3입니다. 기본 Keratinocytes의 재배 단계에서 2.3 keratinocyte 매체에서 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터에서 FCS, 없이 50-70 %confluency 절연 기본 keratinocytes를 품 어. Keratinocytes는 신중 하 게 통로를 매체를 제거 하 고, 5 mL PBS-EDTA, 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어 세포는 가벼운 현미경 문화 플라스 크에서 분리 하기 시작 했습니다 경우 확인 (4 배 확대: 셀 둥근 표시 되지만 여전히 첨부!). 그렇지 않으면, 신선한 PBS-EDTA와 오래 된 PBS-EDTA를 대체 하 고 다시 37 ° c.에 또 다른 10 분 동안 품 어 추가 5 mL 1 x 둥근된 세포를 트립 신-EDTA 여전히 덮여 10 mL PBS-EDTA와 다시 37 ° c.에 1-3 분 동안 그들을 품 어 1 mL FCS를 추가 하 여 효소 반응을 중지 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심, 신선한 T75 셀 문화 술병으로 keratinocyte 매체, 및 씨앗 6 x 105 셀에 펠 릿을 resuspend.참고: organotypic 피부 재구성을 생성 하려면 기본 keratinocytes 사용 되어야 한다 늦어도 3-4을 통과 보다. 4. 진 피에서 기본 섬유 아 세포의 고립 작은 조각 (1 m m2)으로 피부 조직 (단원 1.3)을 잘라내어 50 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송. 10 mL 콜라-솔루션 (PBS+에 5 U/mL)을 추가 하 고 37 ° c.에 물 욕조에 45 분 동안 품 어 조직 조각과 5 분 동안 200 x g에서 셀의 혼합 원심 10 mL DMEM 포함 4.5 g/L 포도 당과 L-글루타민, 두 번 사용 하지 않고 L Pyruvate 셀 펠 릿을 세척. 마지막으로 DMEM gentamycin 1% (v/v) 및 10 S 2 mL에 조직 조각을 resuspend. T25 셀 문화 플라스 크에 그들을 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터에서 밤새 그들을 품 어.참고: 작은 볼륨 조직 파편 마이그레이션할 fibroblasts 있으며 문화 플라스 크를 연결 하는 그들. 다음날 아침, 다른 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS를 추가 하 고 셀에는 80-90 %confluency 도달 했습니다 때까지 37 ° C에서 2-3 일 동안 품 어. 5입니다. 기본 섬유 아 세포의 배양 섬유 아 세포를 통과 하는 매체를 제거 하 고 PBS와 부착 세포를 씻어. 5 mL 1 추가 트립 신-EDTA x 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 및 5 mL DMEM/FCS를 추가 하 여 효소 반응을 중지 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 DMEM 매체에 펠 릿을 resuspend 하 고, 씨앗 6 x 105 셀 신선한 T75 셀 문화 술병으로.참고: organotypic 피부 재구성을 생성 하려면 기본 fibroblasts 사용 되어야 한다 늦어도 4-6을 통과 보다. 6. 3D 흑색 종 Spheroids 메서드를 통해 걸려 드롭의 세대 문화 흑색 종 세포 (예를들면, 451-루, 또는 관심의 모든 흑색 종 세포 라인) 일반 프로토콜을 사용 하 여 10% FCS15포함 된 RPMI에 따르면. 비슷한 크기와 품질의 흑색 종 spheroids 생성, PBS에 흑색 종 세포를 씻어, 1 x는 T175 셀에 PBS에 트립 신-EDTA 문화 플라스 크, 세포 및 실 온 (RT)에서 3-5 분 동안 품 어의 5 mL을 추가. 5 mL RPMI/10% FCS를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리에 의해 셀 다시 중단 셀 펠 릿 RPMI/FCS에 10000 셀/mL는 hemocytometer에 계산 하 여 결정의 최종 농도에 추수. 자리는 세포 현 탁 액 살 균 비 접착제 셀 문화 접시 (Ø 10 cm)의 뚜껑의 안쪽 표면에 전자 멀티 피 펫을 사용 하 여의 (= 250 셀) 40 x 25 µ L. 빠른 하지만 부드러운 움직임, 뚜껑을 돌아서와 5 mL PBS를 포함 하는 각 셀 문화 접시에 놓습니다. 문화 “드롭 요리”에 걸려 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터 사용 셀 종류에 따라 10-14 일.참고: m M 성장 단계에서 세포 일반적으로 빨리 성장 고 매달려 드롭까지 또는 VGP에서 파생 된 흑색 종 세포에 비해 더 단단한 spheroids를 형성 한다. 개별 평가 대 한 회전 타원 체 성장 쌍안경의 쌍에서 또는 가벼운 현미경 (4 배 확대) 아래를 관찰 합니다. 일반적으로, spheroids 쌍안경의 쌍에서 또는 가벼운 현미경 (4 배 확대)에서 48 h 후 감지 된다. 10-14 일 후 그들은 어떤 확대 장치 없이 볼 수 있습니다. 초기 드롭 구경, 후 5 일 각 드롭 신선한 RPMI/10% FCS 매체의 10 µ L를 추가 합니다. 그 후, 매체의 10 µ L 매일 교환 합니다. 전자 디스펜서의 사용은이 단계에서 매우 유용 합니다. 셀 유형에 따라 부드럽게 PBS로 세포 문화 접시 뚜껑 떨어져 rinsing 하 여 (자세한 내용은 섹션 10 참조) spheroids 10-15 일 후 수확. 신선한 비 접착 세포 배양 접시에 그들을 수집 합니다.참고: 재배 기간 종양 성장 단계에 따라 흑색 종 세포의 때 그들은 처음에 파생 했다, 예를 들어, 451-루 셀에서 파생 된 spheroids 성장 약 500 µ m 직경에 매달려 드롭15에서에서 경작의 12 일 이내 . 7. 세대 Organotypic 전체 피부의 피부 구획의 재구성 24 잘 셀 미소 한 구멍이 있는 막 삽입 (기 공 크기 8 µ m) 24-잘 접시에 배치를 사용 하 여 피부 모델을 생성 합니다.참고: 확인 교수형을 사용 하지 않아야 하지만 나중 단계에서 공기 액체 재배 6 잘 플레이트에 배치 될 것입니다 때문에 삽입, 서. MM 및 내 피 성장 미디어 (EGM)16,17이라고 하는 문화 미디어로 서 젤 중화 솔루션 (GNL)15, 준비. 응고를 방지 하기 위해, 저장소는 콜라겐 유형 I (보통에서 쥐 꼬리, 0.02 N 초 산에 3.5-4 mg/mL) 얼음 사용까지 실시간에 젤 시작 하기 때문에 다시 GNL에 삽입 당 1 x 105 fibroblasts을 일시 중지 하 고 신속 하 게 500 µ L/삽입의 최종 볼륨에서 1: 3의 비율로 콜라겐 세포 현 탁 액을 혼합. 거품 형성 거품이 피부의 품질 저하 될 수 있습니다 피하기 위해 아래로 부드럽게 pipetting으로 혼합 재구성 합니다. 유지 하 여 그들 매체 없이 RT에서 30 분 멸 균 후드에 대 한 해결 하기 위해 개별 피부 젤을 허용 합니다. 이후 포도 당 4.5 g/L, 1% 포함 된 DMEM 각 젤 커버 L-글루타민, 10 S, L-pyruvate, 없이 고 37 ° c.에서 밤새 품 어 8. 세대 Organotypic 전체 피부의 상피 구획의 재구성 다음 날 피부 젤에서 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 2 h EGM 미디어 (FCS가 10%, 1 %PenStrep, 10mg/mL gentamicin) equilibrate 매체를 철회 하 고 신중 하 게 피부 젤 위에 100 µ L EGM에서에서 resuspended 1 x 105 keratinocytes 씨앗. Keratinocytes 피부 구획에 있도록 37 ° C에서 1.5 h에 대 한 재구성을 품 어.참고:이 인큐베이션 기간 동안은 젤 구와 유도 수축으로 인해 축소 하 고 따라서, 적어도 부분적으로 삽입 벽에서 분리 하기 시작 합니다. 약 800 µ L EGM 해당 하는 피부를 커버 하 고 신중 하 게 작은 (흰색) 피 펫 팁 삽입 벽에서 잔여 젤을 제거 합니다. 37 ° C, 5% CO2에 셀 인큐베이터에서 7 일 동안 EGM에 빠져들 피부 등가물 문화 고 매일 매체를 변경 합니다.참고:이 시간 동안 해당 하는 피부 수축 됩니다 크게. 9. 공기-액체 재배 Organotypic 전체 피부의 재구성 8 일에 각 전송 6 잘 플레이트의 개별 잘 삽입 합니다. 에 추가할 MM 매체의 1.2-1.4 mL 각 잘 피부 재구성 우물의 바닥에서 매체와 함께 제공 하지만 매체와 적용 되지 않습니다.참고: 공기-액체 인터페이스에서 재배 표 피 부분과 전체 cornified 층 (지층 corneum)의 설립의 계층 수 있습니다. 다음 10 월 17 일 동안 9.1 매일 섹션에 명시 된 매체를 변경 합니다. 이 기간 동안, 약 또는 다른 자극 매체에 필요에 따라 추가 합니다. 조심 스럽게 곡선된 핀셋을 사용 하 여 추가 분석, 예를 들어, immunohistochemical 분석 (그림 1)에 대 한 미소 한 구멍이 있는 막 삽입에서 전체 피부 재구성을 제거. 10. Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델의 생성 Organotypic 전체 피부 재구성의 피부 구획에 흑색 종 spheroids을 통합, 신중 하 게 씻어 교수형의 뚜껑을 (6.4 단계) 후 spheroids PBS와 드롭 셀 문화 접시. 살 균 비 접착제 셀 문화 접시에 10-20 spheroids/삽입을 수집 합니다. 조심 스럽게 제거 파스퇴르 피 펫과 과도 한 PBS. EGM의 작은 볼륨 가능한 spheroids 발음 이 시점에서 관찰 하 고 더 이상 확대 장치 없이 맨 눈으로 spheroids를 계산. 단계 10.1에서에서 명시 된 젤/피부 모델, 당 10-20 spheroids를 가져가 라. (단계 7.3), 섬유 아 세포를 포함 하는 GNL의 원하는 볼륨에 그들을 전송 하 고 콜라겐 유형 나 혼합. 이 단계에서 7.3-9.1 섹션에 설명 된 대로 진행 합니다.참고: 종양 spheroids 표시 되 고 피부 젤에 흰 반점 (그림 2)으로