نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.
Abstract
التحول الخبيث من الخلايا الصباغية، الخلايا الصبغية لجلد الإنسان، يسبب تشكيل لسرطان الجلد، سرطان عدوانية شديدة مع زيادة إمكانات المنتشر. في الآونة الأخيرة، مونو-تشيموثيرابيس مواصلة تحسين بسرطان الجلد تركيبة معينة العلاج بمثبطات كيناز المستهدفة. سرطان الجلد المنتشر لا يزال مرض يهدد الحياة نظراً لأن الأورام يحمل المقاومة الأولية أو تطوير المقاومة للعلاجات الرواية، وبالتالي استعادة القدرات الورمية. ضروري من أجل تحسين نجاح العلاج من سرطان الجلد الخبيث، تحديد الآليات الجزيئية التي تمنح المقاومة ضد نهج العلاج التقليدي؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب نماذج مبتكرة الخلوية في المختبر . هنا، نحن نقدم في المختبر أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد (3D) سرطان الجلد كروي نموذجا يمكن تصور البنية في فيفو الميلانوما الخبيثة وقد تضمن أفكاراً جديدة في داخل الأورام فضلا عن التفاعلات المضيف الورم. النموذج يتضمن أرقام محددة من الماغنيسيوم الميلانوما ناضجة والمتفاوتة في نموذج تعمير 3D جلد الإنسان كامل تتألف من خلايا الجلد الأولية. مركز التكوين والتمايز الخلوي الماغنيسيوم الميلانوما جزءا لا يتجزأ مشابهة للواحدة من الميلانوما الجلدية ورم خبيث في فيفو. استخدام نموذج كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك هذا دواء فحص منصة دعم تحديد المستجيبين لتحديد مجموعة من طرق العلاج، بينما تدخر عبء العلاج غير الضروري لغير المستجيبين، مما يؤدي إلى زيادة الاستفادة من التدخلات العلاجية.
Introduction
جلد الإنسان يتكون من اثنين من الأجزاء الأخرى المتميزة التي تؤدي وظائف مختلفة في حماية الجسم من الآثار الضارة بالبيئة1. حجرة الجلد السفلي يتكون من النسيج الضام الليفي مطاطا. وهو يتألف من ألياف الكولاجين والايلاستين فضفاضة متصلة توليفها من قبل الخلايا الليفية، تخدم وظيفة حاجز ميكانيكية. الأدمة مفصولة من البشرة العليا الصفيحة القاعدية التي تنتج كمصفوفة خارج الخلية بسبب اتصال مستمر بين المقصورات الجلد على حد سواء. وعلى النقيض من باطن الجلد، البشرة ظهارة الحرشفية الذي يتكون أساسا من الخلايا الكيراتينيه ويمكن أن تكون متباينة في أربع طبقات. باسل الطبقة يتكون من غير متمايزة الكيراتينيه القاعدية التي تنبثق باستمرار من خلايا الجلد السلف تساوت خلال مراحل أنواع الطبقة و الطبقة الحبيبية في الطبقة القرنية حماية الجسم من الجفاف والالتهابات2. الخلايا الصباغية هي الانحياز في الغشاء القاعدي، والتواصل من خلال ملحقات الجذعية مع الخلايا الكيراتينيه متعددة. وهي تنتج صبغة الميلانين لحماية أنسجة الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية، مثل شيخوخة الجلد والكبت المناعي والتهاب واستحثاث سرطان الجلد غير الميلانوما. الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعات مساهمة لتحويل الخلايا الصباغية إلى الميلانوما الخبيثة، غير ما زال قيد المناقشة3.
تطوير الميلانوما متباينة في مراحل تطور الورم المختلفة، وتتميز ببعض التغيرات الوراثية والسمات النسجية4. أنها تنشأ أما حيثياته ، أو من وحمة الفطرية أو المكتسبة بسبب محلي زيادة انتشار الخلايا الصباغية تسبب نيوبلسا حميدة. تحويل هذه الآفة السلائف في الأنسجة ديسبلاستيك تم التعديل الهيكلي التي تحتوي على خلايا أتيبيك، التي قد تستمر إلى المرحلة الخبيثة الأولى، في مرحلة النمو شعاعي (RGP). وتتسم هذه المرحلة المبكرة من تطور الورم بالخلايا إشعاعيا تنتشر داخل البشرة، تظهر بعض الخلايا الغازية محلياً داخل الأدمة الحليمية. أثناء سرطان الجلد (VGP) المرحلة اللاحقة من النمو الرأسي إظهار الخلايا فعلا النمط الظاهري المنتشر والغازية باختراق الصفيحة القاعدية لاختراق أعمق أجزاء الأدمة، فضلا عن النسيج تحت الجلد5. وأخيراً، سرطان الجلد المنتشر (مم) يمثل المرحلة التقدم الأكثر عدوانية مع خلايا المنتشر عناصره ينتشر في جميع أنحاء نظام الدم والليمفاوية لغزو ديستالي أجهزة مثل الكبد والرئة والدماغ6.
حتى الآن، لا يزال التشخيص المبكر تليها الجراحة العلاج الأكثر فاعلية لسرطان الجلد الخبيث. غير أن يظل التشخيص للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث البعيدة،7، لا سيما الفقيرة نظراً لنظم العلاج الكيميائي الكلاسيكي يضفي إلا القليل بقاء المنفعة8،9. ومع ذلك، بعد عقود من الركود، التقدم الذي أحرز مؤخرا في العلاجات المستهدفة قد تحسنا التشخيص لسرطان الجلد الخبيث.
التقلبات الكبرى mitogen تنشيط مسارين ورأس-سلاح الجو الملكي البريطاني–مجاهدي خلق-إيرك ومسارات الإشارات PI3K-عكة-فتن، يقدم الدوافع الرئيسية لتطور سرطان الجلد، خصوصا عند تنشيط مؤثرا الطفرات نقطة من BRAFV600 وبروتو و يتم تجاوزها الحالي10. وبناء على ذلك، وعدت اختراع المستهدفة kinase مثبطات فائدة علاجية للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العديد من التجارب السريرية التي أجريت على هذه النقطة لم تحقق فائدة كبيرة للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. ما يقرب من جميع الردود جزئية، مع يتدنى مرضى تظهر المقاومة الأولية. وعلاوة على ذلك، لوحظ اقتناء الثانوي المقاومة مما أدى إلى انتكاسة في أغلبية المرضى11،12.
يصبح من الواضح أن تحليل حالة الطفرة وحدها ليست كافية لوضع استراتيجية علاجية أقوى. أدوات تشخيصية جديدة سريعة وموثوق بها ضرورية لتسجيل بشكل منهجي وتحليل مدى استجابة الخلايا السرطانية الفردية. قد تم الحصول على الغالبية العظمى من البيانات المتاحة حاليا بشأن سرطان الجلد البشري من الثقافات الخلية الميلانوما ثنائي الأبعاد (2D). الخلايا السرطانية، مع ذلك، نمت في 3D يسمح الحديث المتبادل بين الخلايا بين السرطان متمايزة الجمهرات الفرعية الخلية، وكذلك بين الخلايا السرطانية والأنسجة غير حولت المضيفة المحيطة. ولذلك، سيكون من الأفضل لإعادة بناء البيئة ثلاثية الأبعاد التي وضعت سرطان الجلد، لاستخدامها كفحص السريري النموذجي13،14.
Protocol
Representative Results
Discussion
كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد نموذج عرض هنا أوامر رؤى جديدة لفهم أعمق لمداواة البينية والتفاعل المضيف الورم، وقد توفر منصة فحص متقدمة لدراسة الآليات الجزيئية للتنمية الورم و مقاومة العلاج في المستقبل.
لضمان الأفضل الفسيولوجي و في فيفو محاكاة ظروف الجلد يعيد، ونوعية الخلايا الأولية ذات أهمية قصوى. كما ذكر أعلاه، خلايا الجلد الأحداث أو قبل الولادة تظهر على أدنى درجة التمايز وهي بالتالي أفضل مناسبة لتوليد شبه كامل-سمك الجلد. مراقبة الجودة الممكنة الأولى هو مدى انكماش الجلد في اليوم الثاني بعد زرع الخلايا الكيراتينيه واكويليبراتينج الهلام ل EGM (أقسام 8.2 و 8.3 من البروتوكول). سوف يتقلص الهلام الجلد الأكثر مع أفضل نوعية من الخلايا الليفية. أيضا، قد تنال من دمج الخلايا الليفية كثيرة جداً أو قليلة جداً انكماش الجلد ومن ثم تمسك البشرة بحجرة عن طريق الجلد. وهذا بدوره سوف خرق تمايز البشرة، نظراً لأن هذه العملية تتطلب محادثة عبر واسعة النطاق بين خلايا الجلد والبشرة.
وتتوقف نوعية الخلايا الأولية أيضا حاسمة على كونفلوينسي الخلية، فضلا عن مرور الخلايا. إذا كانت الخلايا الكيراتينيه وتزرع على إيه إيت زيرو % كونفلوينسي فورا وقف تكاثر والبدء في التفريق. ولذلك من المهم للثقافة منها إلى 40-70% كونفلوينسي خلال باساجينج واستخدامها لا يتجاوز سن 3-4. الليفية أقل حساسية ولكن لا ينبغي أن تستخدم بعد مرور 4-6. يرجى أيضا ملاحظة أن جميع الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المستخدمة لإنشاء نماذج الجلد كروي الميلانوما أورجانوتيبيك تستزرع خالية من المضادات الحيوية، وذلك خطر تلوث عالية. بيد أن إضافة المضادات الحيوية يتغير فسيولوجيا الخلايا الفردية وذلك يقلل من جودة مكافئات الجلد.
وبصفة عامة، ورم كروي تشكيل الممكن من تقريبا جميع أنواع خطوط الخلايا السرطانية وأيضا الخلايا السرطانية معزولة طازجة من المواد المريض. قد تختلف الوقت عدد و/أو زراعة الخلية الأولى للحصول على أحجام كروي الأمثل اعتماداً على نوع الخلية المستخدمة. تصل إلى حجم من 150-200 ميكرون، كافة الخلايا المدرجة في كروي يمكن لا يزال بما فيه الكفاية توفيره مع المواد الغذائية عن طريق نشر بسيطة. إظهار درجة عالية من التمايز الخلوي فقط الماغنيسيوم مع أحجام إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر وتمثل الميزات النموذجية ل أنسجة الورم غير فاسكولاريزيد22.
أورجانوتيبيك سرطان الجلد-كروي-الجلد-الطراز وضعت هنا مناسبة خاصة لدراسة التفاعلات المضيف الورم واختبار إطار في فيفوالمخدرات سرطان الجلد-مثل الظروف15. لا يزال، البيئة من سرطان الجلد في فيفو حتى أكثر تعقيداً، وإيواء مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السرطانية المرتبطة، بما في ذلك الخلايا المناعية، وخلايا بطانية. منذ إضافة الخلايا المناعية الأولية المناسبة تواجه مشاكل مع هيستوكومباتيبيليتي، هذه النماذج غير قادرة على رصد النهج المناعة العلاجية على نحو كاف.
على الرغم من ذلك، الماغنيسيوم سرطان الجلد يمكن أن تتولد من المواد الطازجة معزولة المريض ومجرد إدراج إعادة البناء الجلد الكامل، قد يخدم كالمخدرات فرادى فحص منصات. حتى إدماج قطعة من ورم خبيث سرطان الجلد في الجلد يعيد بناء المتصور لاختبار تركيبات العقاقير في نهج علاجية مصممة خصيصا. بما في ذلك نموذج الميلانوما الجلد 3D أورجانوتيبيك في التجارب السريرية من المرجح أن تساعد على ضمان إلا رواية العلاجية الواعدة المفاهيم أخذ قدما في التجارب السريرية، مما يقلل من معدل الاستنزاف لعلاجات جديدة محتملة لهذا المرض وزيادة معدل نجاح العلاج في التجارب السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون فورسمان حنا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما-كروي-الجلد-النموذج وتوفير بروتوكولات ممتازة. كما يشكر المؤلفون بوسكه سيلك لقيمة الدعم التقني. وأيده العمل ه الألمانية: برنامج Med 031A423A “سرطان الجلد حساسية”.
Materials
| fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
| Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
| Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
| 24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
| cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
| Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
| Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
| Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
| juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
| Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
| EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
| Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
| Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
| Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
| dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
| L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
| anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
| anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
| anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
| anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |
References
- Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
- Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
- Clark, W. H. Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
- Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
- Miller, A. J., Mihm, M. C. Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
- Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
- Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
- Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
- Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
- Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
- Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
- Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
- Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
- Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
- Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
- Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
