Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.
Abstract
Nauwkeurige controle van transgenic expressie is wenselijk in biologische en klinische studies. Aangezien de binaire functie van momenteel werkzaam gen-switches de overdracht van twee therapeutische expressie eenheden gelijktijdig tot een enkele cel vereist, is de praktische toepassing van het systeem voor gentherapie echter beperkt. Ter vereenvoudiging van het systeem van de expressie transgenic, we genereerden een genen schakelaar uitgeroepen tot pEUI(+) omvat een complete set van transgenic expressie modules in een enkele vector. Bestaande uit het domein van GAL4 DNA-bindende en gemodificeerde EcR (GvEcR), een minimale VP16 activering domein gefuseerd met een GAL4 DNA-bindende domein, alsmede een gemodificeerde Drosophila ecdysone receptor (EcR), de nieuw ontwikkelde enkelvoud gene schakelaar is zeer inspelen op de administratie van een chemische inductor in een tijd – en dosis-afhankelijke manier. De pEUI(+)-vector is een potentieel krachtig hulpmiddel voor het verbeteren van de controle van transgenic expressie in zowel biologisch onderzoek en pre-klinische studies. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor modulatie van een voorbijgaande en stabiele transgenic uitdrukking pEUI(+) vector via de behandeling van tebufenozide (Teb). Daarnaast delen we belangrijke richtlijnen voor het gebruik van Teb als een chemische inductor.
Introduction
Verschillende parameters van de verschillende gen werden onderzocht voor hun vermogen om te precies regelen van transgenic expressie in celkweek en diermodellen, met wisselend succes1,2,3. Potentiële gene schakelaar systemen moeten beantwoorden aan verschillende strenge criteria, met inbegrip van: precieze directionele uitdrukking van de transgenic, dosering – en tijdafhankelijke responsiviteit inductoren, te verwaarlozen leakiness voor de promotor, omkeerbaarheid van transgenic activering door de inductor verwijdering en inductor toxiciteit niveaus draaglijk cellijnen en laboratorium dieren1,2,3. Verschillende kleine molecuul inductoren hebben benut, met inbegrip van tetracycline4,5, rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, en ecdysone11,12,13,14. In het algemeen, deze systemen vereisen minstens twee plasmiden met twee of drie afzonderlijke expressie eenheden, één of twee van die componeren een regelgevende element (inductor plasmide) die een klein molecuul inductor bindt te winnen van transcriptionele activiteit; en een ander plasmide (effector plasmide) met de transgenic onder toezicht van een regelgevende DNA regio waarmee de toegang van het regelgevende element inductor-gebonden. Het grootste nadeel van het binaire systeem is dat het vereist dat de daarmee gepaard gaande invoering van twee vectoren (inductor en effector) in de doelcel. In voorbijgaande transgenic expressie experimenten produceert de gelijktijdige transfectie van twee plasmiden onvermijdelijk een bevolking van cellen die afzonderlijk transfected met de inductor of de effector of mede transfected ongelijk. Bovendien, vereist het binaire systeem ten minste twee rondes van antibiotica selectie om vast te stellen stabiele cellijnen, die tijdrovend en moeizaam. Zo combineren alle onderdelen vereist voor transgenic expressie en verordening in een enkele vector zou ideaal te garanderen van de daarmee gepaard gaande uitdrukking van alle vereiste elementen in één cel en voor de regulering van transgenic expressie door behandeling met klein molecuul inductoren.
Om te overwinnen van de tekortkomingen van binaire gene schakelaars, ontwikkelde we recent een enkelvoud gene schakelaar, met behulp van een Drosophila melanogaster EcR gebaseerde gene afleidbare systeem15. Ecdysone bemiddelt genexpressie wanneer het zich bindt aan de EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer, die op zijn beurt binding van de kassa tot DNA regelgevende elementen3,11 induceert. De gewervelde retinoid X receptor (RXR), een ortholog van insect USP, werft EcR om te vormen van een actieve transcriptionele activator16. Dus, voor de gerichte uitdrukking van een transgenic in gewervelde cellen of weefsel, de EcR en RXR moet mede uitgedrukt gelijktijdig voordat wordt gestimuleerd door ecdysone of haar agonisten. Aangezien de functie van de heterodimeric van de schakelaar EcR gebaseerde gen kan worden beïnvloed door de endogene RXR niveau, Padidam et al.. vervangen van de EcR DNA-bindende en activering domeinen met heterologe GAL4 DNA-bindende, herpes simplex virus eiwit vmw65 (VP16) activering domeinen gesmolten bij het EcR ligand-bindend domein, die vervolgens werd gereageerd op de endogene RXR en vormde een homodimer verwerven van transcriptionele activiteit17. De schakeloptie gene EcR gebaseerde is verder verbeterd door de aanleg van een chimeer eiwit samengesteld van minimale VP16 activering domein gecombineerd met GvEcR, die een homodimer gevormd en gelokaliseerd in het cytosol in het ontbreken van de ecdysone-agonist, Teb16, 18. Door binding aan Teb, veranderde de GvEcR haar subcellular localisatie van het cytosol tot de kern te herkennen een promotor van de hybride bestaat uit zebrafish E1b minimale promotor gecombineerd met een tien tandem herhaalde upstream activering sequenties (UASs) op gang te brengen de transcriptie van de target gene16.
Ter vereenvoudiging van de eerder gemelde EcR gebaseerde gene schakelt16,18, we de binaire eigenschappen van het systeem gecombineerd in een enkele vector uitgerust met alle vereiste elementen voor stimulerende transgenic expressie, en vervolgens aangewezen de nieuw gegenereerde vector, pEUI(+) (GenBank toetreding nummer: KP123436, figuur 1A)15. De effector reageren op het GvEcR-stuurprogramma (hierna rijder) bestaat uit tien tandem UAS herhaalt naast een minimale promotor van E1b, gevolgd door een meerdere klonen site (MCS) met EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI en AflII erkenning sequenties (figuur 1B). Bovendien, om de selectie van transfected cellen, een SV40 promotor-gedreven puromycin N-acetyl-transferase (PAC) gen werd geplaatst tussen de bestuurder en effector regio’s te handhaven van stabiele cellijnen (Figuur 1).
Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbijgaande en stabiele modulatie van transgenic expressie met behulp van pEUI(+). Daarnaast bieden we gedetailleerde instructies voor een succesvol gebruik van Teb als een agonist van het ecdysone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het grootste nadeel van een binaire gen expressie schakeloptie is de noodzaak om tegelijkertijd leveren twee aparte plasmiden (bestuurder en effector) in de doelcel. Dit kan leiden tot een ongelijke verdeling van plasmiden en leiden tot een inconsistente reactie van de overgang naar de inductoren1,2,3. Een andere tekortkoming van de twee-vector systeem is dat een minimum van twee rondes van antibiotica selectie moeten identifice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken S-Y Choi (Chonnam National University) voor waardevolle opmerkingen en grondige lezing van onze manuscript. Dit werk werd gesteund door een fonds voor onderzoek van de Chungnam National University.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
