JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

Published: April 20, 2018
doi:
10.3791/57479
,
1Cluster of excellence CellNetworks,Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتقسيم-بيويد، مقايسة شظايا-تكامل بروتين استناداً إلى تقنية الوسم قرب بيويد. تنشيط على التفاعل بين اثنين من البروتينات معينة، يتيح تحليل البروتيوميات مجمعات البروتين تعتمد على السياق في بيئتها الخلوية الأصلية. الطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ويتطلب معدات المختبرات القياسية فقط.

Abstract

لتكملة القائمة انجذاب تطهير (AP) نهج لتحديد تفاعلات البروتين البروتين (PPI)، أدخلت إنزيمات تسمح العلامات المعتمدة على مقربة من البروتينات في الخلايا الحية. واحد هذه الإنزيم، البيرا * (المستخدمة في نهج بيويد)، يتوسط بيوتينيليشن البروتينات ضمن مجموعة من حوالي 10 نانومتر. ومن ثم، عندما تنصهر وتين فائدة والمعبر عنها في الخلايا، فإنه يسمح وسم البروتينات الدانية في بيئتها الأصلية. مقابل وكالة اسوشييتد برس التي تعتمد على تنقية البروتين المجتمعون المجمعات، يكشف بيويد البروتينات التي تم تمييزها داخل الخلايا بغض النظر عن ما إذا كان أنها لا تزال تتفاعل مع بروتين الفائدة عندما تكون معزولة. نظراً لأنه بيوتينيلاتيس البروتينات الدانية، واحد يمكن علاوة على ذلك الاستفادة من تقارب استثنائية من ستريبتافيدين البيوتين الغاية كفاءة عزلها. بينما بيويد أداؤها أفضل من وكالة اسوشييتد برس لتحديد عابرة أو التفاعلات الضعيفة، كلا النهجين قياس الطيف الكتلي AP-بيويد الجماعية وتقديم لمحة عامة عن جميع التفاعلات المحتملة قد يكون بروتين معين. ومع ذلك، لا توفر المعلومات في سياق كل بيكسل في البوصة المحددة. والواقع أن معظم البروتينات تعتبر عادة جزءا من عدة مجمعات، المقابلة لخطوات متميزة من النضج أو وحدات وظيفية مختلفة. لمعالجة هذا القيد المشترك لكلا الأسلوبين، أننا قد إجراء هندسة عكسية مقايسة تكامل شظايا بروتين استناداً إلى الإنزيم البيرا *. في هذا التحليل، يمكن إعادة تجميع الأجزاء الخاملة اثنين من البيرا * في إنزيم نشط عند إقامتها بالقرب من اثنين من البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها. وهكذا يسمح الإنزيم بيويد تقسيم الناتج وسم البروتينات أن التجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة. سبليت-بيويد شريطة إلا هذين التفاعل في سياق معين، ثم يسمح تحليل وحدات وظيفية محددة تعتمد على السياق في بيئتها الخلوية الأصلية. هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لاختبار وتطبيق انقسام-بيويد على زوج من البروتينات المتفاعلة.

Introduction

كما تنفذ المهام الأكثر الخلوية بالبروتينات بشكل حيوي تجميع الجزيئات المجمعات، تحديد تفاعلات البروتين البروتين (PPI) مسعى رئيسيا في البحوث الطبية الحيوية. وفي الواقع، PPI غالباً ما رفع الضوابط التنظيمية في المرض وتمثل أهدافا محتملة للتداوي1. الأكثر استخداماً طريقة لتحديد مؤشر أسعار المنتجين هو نهج تنقية (AP) تقارب فيها، عقب تحلل الخلية، على وجه التحديد هو تنقية وتين فائدة في مصفوفة والبروتينات المرتبطة بها يتم تحديدها لاحقاً بواسطة الكتلي (مللي ثانية). بينما AP-مرض التصلب العصبي المتعدد نهج قوية، عادة لا أداء جيدا على مجمعات البروتين ضعيفة الذوبان، وتفاعلات عابرة جداً أو PPI التي تتطلب بنية سليمة سوبسيلولار. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون معقدة الطابع الدينامي لشبكات PPI، تفسير البيانات بروتين وحيد هو غالباً جزء من عدة مجمعات البروتين متميزة.

تم مؤخرا تطوير تقنيات الوسم قرب مثل بيويد2 أو3،APEX24 لمعالجة بعض أوجه قصور نهج AP-مرض التصلب العصبي المتعدد. في بيويد، يحفز إنزيم البيرا * (المقابلة لمتغير G115R إنزيم كولاي نوع البرية) تشكيل مجا بيوتينيل أمبير (بيو-أمبير) التي يمكن أن تتفاعل مع الأمينات الأولية. مقابل الإنزيم نوع البرية، التي تحتفظ بالحيوية-أمبير في مركز نشط، البيرا * النشرات بيو-أمبير مما يسمح نشرها في البيئة المجاورة لها. ومن ثم، عندما تنصهر وتين اهتمام وأعرب عنها في الخلايا، يمكن أن تكون البروتينات الدانية بيوتينيلاتيد ضمن مجموعة ما يقدر 10 نانومتر5. وهذه علامة الدانية البروتينات ثم تم عزلة بواسطة streptavidin المنسدلة وتحديد من مرض التصلب العصبي المتعدد. مقابل AP-مرض التصلب العصبي المتعدد، يتطلب بيويد التعبير عن البروتين الانصهار. فإنه يمكن وبالتالي تطبق فقط على البروتينات التي لا يعوقها مهمتها وضع علامات. وعلاوة على ذلك، سرعة وضع العلامات بطيء، عادة 6 – 24 ح2،6، مما يجعل الكشف عن البروتينات لم تدم طويلاً الصعبة. حتى الآن، بالمقارنة مع وكالة اسوشييتد برس-MS، MS بيويد يوفر العديد من المزايا الرئيسية: أولاً، أن يلتقط التفاعلات في بيئتها الخلوية الأصلية؛ البروتينات الثاني، المسمى بدلاً من تجميعها في مجمعات معزولة وعقب تحلل الخلية؛ ثالثا، بولدوونس ستريبتافيدين تسمح باستخدام المخازن المؤقتة يشوه وظروف قاسية الغسيل. ومن ثم فالاسلوب أكثر حساسية للكشف عن التفاعلات التي تحدث في محدد أو عابرة أو التفاعلات الضعيفة7 ومن الصعب عزل الهيكل سوبسيلولار8.

ومع ذلك، معظم البروتينات تشكل عادة جزءا من المجمعات الكبيرة التي يمكن إعادة تشكيلها وفقا للإشارات الخلوية أو الدالة التي تحتاج إلى إجراء. ومن ثم، بروتين وحيد عادة جزءا من عدة مجمعات، المقابلة للوحدات الوظيفية المتميزة، التي تشمل متميزة و/أو تداخل PPI. كلا النهجين إعطاء لمحة عامة عن جميع الجمعيات قد يكون بروتين معين، لكنها أخفقت في معالجة سياق PPI الفردية. لزيادة دقة هذا الأخير، لقد قمنا بتصميم مقايسة تكامل شظايا بروتين (PCA) في يمكن فيه الشظايا غير نشط اثنين من البيرا * (نبيرا *، الذي يحتوي على المجال الحفاز، وكبيرى * يمكن عرضها كالمجال إعادة التنشيط) يحشدوا في إنزيم نشط عندما جلبت على مقربة من قبل اثنين تتفاعل البروتينات9. الإنزيم بيويد تقسيم الناتج يركز بيوتينيليشن قرب تعتمد على البروتينات التجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة، ويسمح بالتالي تحديد سياق البروتين تعتمد الجمعيات. أظهرنا سلطة القرار المعلقة من سبليت-بيويد مؤخرا بحل مجمعين البروتين المتميزة المشاركة في وساطة ميرنا إسكات الجينات المسار9.

بالإجمال، في مقايسة واحد وبسيط، يسمح سبليت-بيويد اكتشاف، وعلى وجه التحديد تعيين PPI للوحدات الوظيفية المحددة التي تشارك بروتين معين، قدمت المعروف بروتين متفاعلة إضافية من البروتين المقابل المعقدة.

Protocol

ملاحظة: لمحة عامة عن الأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. 1-التخطيط لاستراتيجية الاستنساخ حدد اثنين البروتينات المتفاعلة مزعومة لفحصها.ملاحظة: كل من البروتينات هما سوف تنصهر إلى أحد بيويد تقسيم جزء: أما نبيرا * أو كبيرى *. كعنصر سلبي، سيتم اختبار البروتينات الانصهار كبيرى * مع نبيرا * تنصهر فيها البروتينات الفلورية الخضراء (نبيرا *-التجارة والنقل). نبيرا * الأنشطار كعنصر تحكم إضافية، قد يتم اختبار وحدها، دون الانصهار كبيرا * المشابهة أو بالاقتران مع كبيرا * تنصهر فيها بروتين لا علاقة لها. من المستحسن عدم استخدام كبيرى *-التجارة والنقل كعنصر تحكم سلبية كما أبدى دائماً تؤدي إلى الخلفية الرئيسية عند اقترانها بأي نبيرا * الانصهار البروتين9. قد يكون سبب هذه الملاحظة مستوى التعبير كبيرى *-التجارة والنقل، أعلى بكثير من أي كبيرى * الانصهار البروتينات الأخرى وقد استخدمنا حتى الآن، يمكن أن تؤدي إلى تنم كبيرة مع الجزء نبيرا *. حالما يتم تحديد اثنين من البروتينات، تحقق من الأدب البحث عما إذا كان كلاهما قد فعلا تم بنجاح يوصف بأنه في الدراسات الفنية (على سبيل المثال بروتين انصهار معلم التجارة والنقل). في حالة وجود مثل هذه الدراسات، نلاحظ موقف العلامة (في ن-أو ج-المحطة) واستخدم نفس اتجاه للوسم البروتينات للفائدة مع شظايا الانقسام-بيويد. في حالة وجود لا دراسة من هذا القبيل، معلم في المحطة N و C ثوابت خطة الترميز لكل البروتينات وخطة فحص لاختبار الأداء الوظيفي للبروتينات الانصهار (على سبيل المثال، تجربة إنقاذ في خط خلية المستنفد للبروتين WT).ملاحظة: عند إقران اثنين الانصهار البروتينات باستخدام البلازميدات المبينة في الشكل 2 ترميز linkers طويلة مرنة، توجه البروتينات الانصهار (البيرا * شظايا تنصهر المنبع أو المصب من البروتينات للفائدة) عموما لا يهم . بل استخدام FRB وفكبب كنموذج البروتينات، فقد تبين أن جميع التكرارات المحتملة الأربعة (كل الأجزاء في ن تيرميني، سواء في ج تيرميني، واحدة في ن-المحطة والأخرى ج-المحطة، والعكس بالعكس) تسفر عن المقارنة بيوتينيليشن9. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم Orf البروتينات هما من اهتمام للاستنساخ في والبلازميدات سبليت-بيويد. انتبه أن الإطارات الترجمة هي نفس الأجزاء البيرا *. إذا كان استخدام البلازميدات هو موضح في الشكل 2، استخدام الإنزيمات تقييد بميي وباشي بناء الانصهار كبيرى *، والأنزيمات قارتهم وملوي للانصهار نبيرا *.ملاحظة: حمل والبلازميدات هو مبين في الشكل 2 عنصر تيت استجابة ثنائية محاط بمواقع جزئ F3/معاهدة سجل الأفلام. يسمح هذا التعبير المشترك ينظم نفس المستوى تقريبا كل البروتينات الانصهار من بلازميد نفسه10، وإمكانية لسرعة بناء خطوط الخلايا مستقرة قبل اقترانها بوساطة كاسيت exchange (رمس). في هذه البلازميدات، نبيرا * لديه علامة حركة بينما كبيرى * علامة علم. وبطبيعة الحال يمكن أيضا استنساخ Orf على والبلازميدات الفردية مع المروجين التأسيسي.الخطوة الحاسمة: عند اختبار اثنين من البروتينات المتفاعلة، من المستحسن مقارنة نبيرا * تنصهر فيها البروتين 1 جنبا إلى جنب مع كبيرى * تنصهر للبروتين 2، ونبيرا * تنصهر للبروتين 2 جنبا إلى جنب مع كبيرى * تنصهر فيها البروتين 1. وفي الواقع، كثيرا ما لوحظ أن تكرار واحد يعمل بشكل أفضل من غيرها. 2-الاستنساخ Orf الجينات من الفائدة في بلازميد سبليت–بيويد ملاحظة: في هذا المثال، تعتبر اثنين من البروتينات التي يمكن تمييزها في ن-المحطة. وسيتم اختبار أربعة شروط ومقارنة مع غير transfected الخلايا (الجدول 1). استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم Orf البروتينات اثنين لفحصها مع الإشعال المناسبة. تصميم الإشعال الذي يعرض المواقع تقييد قارتهم وملوي للبروتينات الانصهار نبيرا *، ومواقع باشي وبميي للبروتينات الانصهار كبيرى *.ملاحظة: بكر يمكن تنفيذها مع أي التجارية، ترتبط بشكل تفضيلي تصحيح التجارب المطبعية، بوليميراز الدنا. يتبع البروتوكول القياسي من الكتيب وتكييفه مع درجة حرارة ذوبان الإشعال وطول ORF تضخيم طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. سوبكلون ORF الأولى هضم بلازميد (حوالي 2 ميكروغرام) وتضخيم بكر ORF1 (أن تنصهر فيها إلى نبيرا *) مع قارتهم وملوي. القيام بردود فعل الهضم استخدام ميكروليتر 1 لكل إنزيم، مختلطة مع حجم المخزن المؤقت للحمض النووي، ورد فعل في إجمالي حجم 20 ميكروليتر في أنبوب 1.5 مل ح 1 في 37 درجة مئوية للمناسبة تشغيل كلا عينات الهضم على جل 1% [اغروس]-تاي الحمض النووي. المكوس العصابات تناظر بلازميد هضمها و ORF1 مع مشرط نظيف ونقل إلى أنابيب 1.5 مل. تنقية العصابات على حد سواء باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي قياسية. اضطر بلازميد هضمها و ORF1 استخدام الكواشف القياسية. في حالة استخدام مجموعة أدوات ربط المشار إليها في الجدول للمواد، اضطر 100 نانوغرام من الحمض النووي الذي يحتوي على إدراج ثلاث إلى خمس الوقت الزائد المولى على بلازميد في إجمالي حجم 4.5 ميكروليتر. إضافة 5 ميكروليتر من 2 x T4 ليجاسى العازلة وميكروليتر 0.5 من ليجاسى T4 الحمض النووي من أدوات ربط. القيام برد فعل ربط في أنبوب 1.5 مل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تحويل الخلايا المختصة DH-5α كولاي القياسية (أعدت وفقا لأسلوب إينو في11). ميكروليتر 3 مزيج من رد فعل ربط مع 50 ميكروليتر من الخلايا المختصة في 1.5 مل الأنبوبة على الجليد واحتضانها ل 30 دقيقة نقل الخلايا لحرارة كتلة مجموعة إلى 42 درجة مئوية ل s 30-45 واحتضان ثم مرة أخرى على الجليد للحد الأدنى 2 إضافة 250 ميكروليتر المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) ليسوجيني مرق (رطل) المتوسطة ولوحة 100 ميكروليتر من الخلايا على طبق أجار رطل المحتوية على الأمبيسلّين المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية). احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، اختر أربعة إلى ستة مستعمرات واحتضانها لهم عند 37 درجة مئوية، 180 لفة في الدقيقة، بين عشية وضحاها في 3 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 100 μg⋅mL-1 الأمبيسلّين في أنبوب 15 مل. عزل البلازميدات من المستعمرات التقطت باستخدام مجموعة “الحمض النووي مينيبريب” قياسية. التحقق من صحة والبلازميدات قبل سانغر التسلسل باستخدام 2 كاسيت عكس التمهيدي (الجدول 2). بمجرد تم التعرف بلازميد يحتوي على ORF الأولى، سوبكلون ORF الثانية في ذلك بلازميد اتباع نفس الخطوات كخطوة 2.2 ولكن استخدام الإنزيمات بميي وباشي. التسلسل والبلازميدات الناتجة عن استخدام التمهيدي 1 كاسيت عكس (الجدول 2). 3-اختبار من البروتينات الانصهار ملاحظة: الإرشادات التالية والبلازميدات التعبير إيندوسيبلي المزدوج (الشكل 2) و 11ht هيلا الخلايا، خط الخلية هيلا-CCL2 سوبكلونال، ستابلي معربا عن النسخ العكسي تسيطر عليها التتراسيكلين المنشط رتا-M2 والتي تحتوي على محور رمس12. متوسط النمو لهذه الخلايا من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين خالية من التتراسيكلين (FBS). عند استخدام نوع آخر من الخلايا، ظروف بذر الدقيق والمتوسطة النمو سوف تحتاج إلى تكييف. تعداء عابرة خلايا البذور بتركيز 1 × 105 خلايا في 2 مل كل من صفيحة ستة-جيدا جيدا في اليوم السابق تعداء واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في حاضنة ثقافة خلية الخلايا. في يوم تعداء، إزالة وسيلة لكل بئر واستبدال مع 2 مل متوسطة جديدة. إعداد ردود فعل تعداء الأربعة وفقا الجدول 1. لكل بئر ترانسفيكت، إضافة 6 ميكروغرام من بولييثيلينيميني إلى 3 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي في أنبوب عقيم 1.5 مل والتعبئة إلى 500 ميليلتر مع المتوسطة دميم دون المصل. احتضان كل مزيج تعداء لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة قطره من الحكمة لكل بئر. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. الاستقراء ووضع العلامات قرب إزالة المتوسطة اليوم بعد تعداء، واستبدل بالمتوسطة وتستكمل مع البيوتين في 50 ميكرومتر لتحفيز بيوتينيليشن والدوكسيسيكلين 200 ng⋅mL−1 للحث على التعبير عن البروتينات الانصهار. احتضان الخلايا على الأقل 20 ح في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. لجعل حل أسهم من البيوتين، حل البيوتين في 50 mg⋅mL-1 (تناظر ca. 200 ملم) في هيدروكسيد الأمونيوم 2 متر. بمجرد أن يذوب تماما، تمييع إلى 50 مم في 500 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4، ثم ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. قاسمة وتخزين 1,000 الناتجة x حل الأسهم عند-20 درجة مئوية. حل الدوكسيسيكلين mg⋅mL 10-1 في الإيثانول 70% ومخزن في microtube ملولبة في-20 درجة مئوية في الظلام. إعداد ليستي الخلية تغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل الباردة (4 درجة مئوية) مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). لكل بئر، إضافة 100 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 0.5% NP-40، 0.5 مم DTT ومثبطات البروتياز). حصاد الخلايا مع خلية المزيل ونقل إلى أنابيب 1.5 مل. الطرد المركزي هذه العينات في س 14,000 ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الحطام خلية. نقل سوبيرناتانتس بأنابيب جديدة ووضع على الجليد. تحديد كميات البروتين مع مقايسة برادفورد. الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام التفريد (صفحة) وغرب النشاف تحضير هلام polyacrylamide الحزب الديمقراطي الصربي. لمسح كل ليساتي، إعداد نموذج صفحة 30 ميكروغرام (الحد الأدنى 15 ميكروغرام) البروتين في ما مجموعة 30 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي-تحميل المخزن المؤقت. قم بتحميل كميات متساوية لكل عينة (20 ميليلتر في البئر) في جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide والمضي قدما بالتفريد. بعد التفريد، نقل البروتينات هورمونات لغشاء وصمة عار PVDF فلورية منخفضة باستخدام أي بروتوكول قياسي.ملاحظة: لتحليل البروتين بيوتينيليشن، وقت نقل 10 دقيقة مع برنامج “ميغاواط عالية” بسرعة نقل شبه الجاف الغربية النشاف الجهاز عادة ما يعمل بشكل جيد. بعد النقل، كتلة الغشاء في الحليب الجاف 5% في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في الرايت احتضان الغشاء لمدة 30 – 60 دقيقة في الرايت مع streptavidin نيون 1:15,000 المخفف المتقارنة في برنامج تلفزيوني يحتوي على جيش صرب البوسنة 2% و 0.1% توين-20. يغسل الغشاء ثلاث مرات، كل منها لمدة 10 دقائق، مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% 20 توين، ومرة واحدة ثم أكثر مع برنامج تلفزيوني. مسح الغشاء على نظام تصوير الماسح ضوئي الأسفار.ملاحظة: هو وصمة عار الغربية نموذجية يظهر في الشكل 3. يصف الإجراء أعلاه كشف على أساس الفلورسنت ولكن كشف على أساس التﻷلؤ ستريبتافيدين إلى جانب برنامج الصحة الإنجابية باستخدام نفس القدر يعمل بشكل جيد. 4-سبليت-بيويد للدراسات البروتيوميات ملاحظة الحاسمة: يجب أن تكون جميع المواد والمواد الكاشفة للتحليل الشامل والمطيافيه النهائي، جميع الخطوات التالية تتم في ظروف خالية من الكيراتين، خالية من الكيراتين قدر الإمكان. تعداء عابرة قبل تعداء، اليوم البذور 10 سم ثلاث أو أربع لوحات لكل شرط بتركيز 8 × 105 خلايا في 10 مل للوحة الواحدة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في حاضنة ثقافة خلية الخلايا. في اليوم التالي، إعداد مزيج تعداء رئيسي لكل شرط تعداء: ثلاثة لوحات كل شرط، 36 ميكروغرام من بولييثيلينيميني، و 18 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي حله في ميليلتر 900 دميم خالية من المصل. احتضان كل مزيج الرئيسي لمدة 5 دقائق على الأقل في الرايت وفي الوقت نفسه، يستعاض عن المتوسط لكل طبق بمتوسطة جديدة، ثم قم بإضافة 300 ميليلتر من انخفاض خلائط تعداء الحكمة لكل لوحة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. الاستقراء ووضع العلامات قرب في اليوم التالي تعداء، نقل الخلايا إلى الأطباق 15 سم. لكل طبق، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع مل 7 من برنامج تلفزيوني، وإضافة 1.5 مل حل يدتا التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت إضافة 3.5 مل من متوسط النمو ريسوسبيند الخلايا ونقل تعليق خلية إلى طبق 15 سم مليئة 20 مل متوسط النمو تستكمل مع البيوتين في 50 ميكرومتر لتحفيز بيوتينيليشن والدوكسي في 200 ng⋅mL1 (تركيزات النهائي) للحث على التعبير عن البروتينات الانصهار. احتضان الخلايا على الأقل 20 ح في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. الحصاد والتخزين للخلايا تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 1.5 مل من برنامج تلفزيوني لكل لوحة وحصاد الخلايا مع المزيل. نقل الخلايا المقطوع المقابلة لشرط واحد لأنبوب 15 مل وحصادها بالطرد المركزي في 1,200 س ز، دقيقة 5، 4 درجة مئوية. إزالة سوبيرناتانتس وتجميد الأداة الكريات في النتروجين السائل، ثم تخزين عند 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.ملاحظة: بدلاً من ذلك، الخلايا يمكن أيضا فصل من تريبسينيزيشن، وتحصد في المتوسطة النمو، نقل إلى أنبوب 15 مل وغسلها وقت الثلاثة مع برنامج تلفزيوني قبل تجميد. إعداد خلية ليساتيس ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 0.4% الحزب الديمقراطي الصربي، 5 ملم يدتا، 1 مم DTT، 1 x مثبط البروتياز كاملة) في تمرير الرايت الخلايا 10 – 20 مرة (خمسة إلى عشرة السكتات الدماغية) من خلال إبرة 25 جرام. Sonicate العينات باستخدام جهاز صوتنه.ملاحظة: مع الجهاز صوتنه المشار إليها في الجدول للمواد، التالي يمكن استخدام البرنامج: أربع دورات في كثافة عالية، 30 ثانية لكل دورة في برد (4 درجة مئوية) حوض ماء. أي جهاز صوتنه ومناسبة ولكن المعلمات قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لذلك. إضافة X-100 تريتون إلى تعافي سونيكاتيد التوصل إلى تركيز نهائي 2% (عادة، بإضافة 100 ميكروليتر 20% سونيكاتيد Triton X-100 إلى ميكروليتر 900 الخلية ليستي)، وثم 2.3 مل من 50 مم تريس، pH = 7.4 كل 1 مل من لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 مم قبل ب إيندينج إلى ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز.ملاحظة الحاسمة: وكثيراً ما تسفر أعلى تركيزات الملح أقل بكثير من كفاءة الربط بالخرز. توزيع ليساتيس المعدلة في أنابيب 1.5 مل (ca. 1.1 مل في الأنابيب الثلاثة) والطرد المركزي لهم في 16,000 س ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس (ca. 3.2 مل) إلى الأنبوبة 15 مل، وإبقاء 50 – 100 ميكروليتر كمواد المدخلات. قياس تركيز كل عينة مع مقايسة برادفورد واستخدام ما يعادل 3 إلى 3.5 ملغ من البروتين المنسدلة ستريبتافيدين. ستريبتافيدين المنسدلةملاحظة: يتم عرض لمحة عامة عن الإجراء المنسدلة في الشكل 4. أنها تكاد تكون متطابقة في البروتوكول الأصلي نشرتها رو والزملاء2. المرة الأولى يتم تنفيذ الواقعة، عينات من التدفق من خلال والغسيل 1 – 4 يجوز طرحها جانبا لتحليل لطخة غربية لضمان الإجراء يعمل بشكل صحيح (الشكل 5). لكل حالة، ونقل 200 ميكروليتر من وقف إلى جانب streptavidin المغناطيسي الخرز إلى أنبوب 1.5 مل. وضع الأنابيب على رف مغناطيسية، والانتظار حتى الخرز العصا إلى جانب الأنابيب (ca. 1 دقيقة) وإزالة المخزن المؤقت التخزين. أغسل الخرز بالاختلاط بلطف مع 1 مل من المخزن المؤقت للموازنة (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7 – 4، 150 كلوريد الصوديوم، 0.05% X-100 تريتون، و 1 ملم DTT). إرسال الخرز متوازن في كمية متساوية في العدد اللازم من أنابيب (عادة عند بدء تشغيل مع البروتين 3 – 3.5 ملغ المحتوى، يمكن إرسالها ليساتيس من كل شرط في اثنين إلى أربعة أنابيب 1.5 مل) والمكان مرة أخرى على الرف المغناطيسية. إزالة المخزن المؤقت الموازنة وريسوسبيند كل مجموعة من الخرز مع كميات متساوية من ليساتيس الخلية المقابلة من الخطوة 4.4.7. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. في اليوم التالي، ضع أنابيب 1.5 مل على رف مغناطيسي، انتظر حتى الخرز العصا إلى جانب الأنابيب ونقل سوبيرناتانتس إلى أنبوب 15 مل وصفت بأنها “تتدفق من خلال”.ملاحظة: من الآن فصاعدا، كل الخطوات التي تتم في درجة حرارة الغرفة، ما لم يبين خلاف ذلك. ريسوسبيند الخرز في كل أنبوبة مع 200 ميكروليتر يغسل المخزن المؤقت 1 (2% الحزب الديمقراطي الصربي في الماء)، والجمع بين كل مجموعة من الخرز حراكه المقابلة لشرط واحد في أنابيب 1.5 مل. تغسل حبات مرتين لمدة 8 دقائق على عجلة تناوب مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1. أغسل حبات مرتين لمدة 8 دقائق على عجلة تناوب مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 (50 مم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 1 مم يدتا، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1% Triton X-100، و 0.1% Na-ديوكسيتشولاتي). أغسل حبات مرتين لمدة 8 دقائق على عجلة تناوب مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 3 (10 ملم تريس pH 8, 250 مم ليكل، 1 مم يدتا، 0.5% NP-40، و 0.5% Na-ديوكسيتشولاتي). أغسل حبات مرتين لمدة 8 دقائق على عجلة تناوب مع 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل 4 (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 50 مم كلوريد الصوديوم، 0.1% NP-40). للتأكد من المخزن المؤقت يغسل هو إزالتها بالكامل بعد غسل آخر خطوة، إزالة معظم المادة طافية، وتدور ثم أسفل العينات. وضعها على الرف المغناطيسي، انتظر حتى الخرز العصا إلى جانب الأنابيب ثم قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقية. إضافة 30 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، الحزب الديمقراطي الصربي 2% و 5% β-mercaptoethanol 2 مم البيوتين) الخرز. احتضان عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم على الفور إزالة الخرز على رف مغناطيسية. نقل العينة التيد إلى أنبوب جديد ومخزن في-20 درجة مئوية إلى مزيد من المعالجة. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربيةملاحظة: قبل تحليل الطيف الكتلي، يوصي بتقييم نجاح بيوتينيليشن والمنسدلة بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي ولطخة غربية. إذا لوحظ نمط بيوتينيليشن لا واحد قد نعتبر أن دوكس أو البيوتين لم تتم إضافته إلى المتوسط أو أن أحد الحلين الأوراق المالية للخطر. لكل نموذج الإدخال، إعداد نموذج صفحة عن طريق خلط كميات متساوية من البروتين العينة مع حجم المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي-تحميل x 3 في إجمالي 28 ميكروليتر المناسبة. تحضير عينات الصفحة بخلط 5 ميليلتر من كل عينة شطف مع ميليلتر 2.5 x 3 صحيفة بيانات السلامة-تحميل المخزن المؤقت. تحميل العينات (25 ميليلتر/جيدا للمدخلات، 7 ميليلتر/حسنا لعينات شطف) على هلام polyacrylamide الحزب الديمقراطي الصربي. المضي قدما بالتفريد والغربية النشاف كما هو موضح في المقطع 3.4. إذا كان أداء المنسدلة للمرة الأولى، إعداد صفحة عينات لكل خطوة من المنسدلة (الإدخال، التدفق من خلال شطف 1 – 4، المياه والصرف الصحي) عن طريق خلط 20 ميليلتر لكل عينة (الإدخال، التدفق من خلال الغسيل 1 – 4) مع 10 ميليلتر من 3 × صحيفة بيانات السلامة-تحميل المخزن المؤقت أو 5 ميليلتر (شطف) مع ميليلتر 2.5 3 x S س-تحميل المخزن المؤقت، والمضي قدما في خطوة 4.6.4 (الشكل 5). الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعددملاحظة: لتقليل التلوث المحتملة بالكراتين، الهلام الجاهزة والعينات التجارية تحميل المخزن المؤقت يمكن استخدام. إضافة ميكروليتر 6.25 x 4 عينة المخزن المؤقت إلى 18.75 ميكروليتر من كل عينة شطف وتشغيل العينات على الحزب الديمقراطي الصربي 4 – 20% الجاهزة-هلام حتى تهاجر 2 – 3 سم إلى الهلام. وصمة عار الهلام مع أخذ الغروية الرائعة G250 الأزرق تلطيخ13 في طبق بتري 15 سم. استخدام مشرط نظيف للمكوس حارات كاملة لكل عينة، باستثناء الفرقة ستريبتافيدين (يعمل في كاليفورنيا-17 كاتشين، الشكل 6)، ونقل الأشرطة قصت لأنابيب 1.5 مل. إرسال هذه العينات إلى مرفق البروتيوميات لمزيد من التحليل.ملاحظة: النتائج النموذجية مرض التصلب العصبي المتعدد يمكن تبينه من المرجع 9 (رقم 3 و رقم 7، وجداول تكميلية). تتوفر مجموعات البيانات كاملة على المستودع فخر (رقم الانضمام PXD005005).

Representative Results

لتوضيح كيف يعمل هذا الأسلوب، إطارات القراءة المفتوحة (Orf) من البروتينات Ago2، TNRC6C وديسير (جميع المعنيين في الجينات بوساطة ميرنا إسكات المسار) قد تم استنساخ في سبليت-بيويد والبلازميدات. ومن المعروف Ago2 للتفاعل مع TNRC6C داخل المستحثة ميرنا إسكات معقدة (ميريسك) التي تقمع الترجمة وحفز تسوس الهدف مرناس14. السابقة لتجميع ميرسك، Ago2 التفاعل مع ديسير، الإنزيم الذي ينتج ميرناس ناضجة، داخل مجمع التي قد تحصل على تحميل مع ميرنا15. ومن ثم طبقت سبليت–بيويد Ago2/ديسير الزوج أو الزوج Ago2/TNRC6C. لكل زوج من البروتينات المختبرة، كان Ago2 أما تنصهر نبيرا * أو * كبيرى استخدام لدينا والبلازميدات سبليت-بيويد (الشكل 2)، وتفتيت ديسير و TNRC6C إلى البيرا المشابهة * المقابلة. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت كل البروتين تنصهر فيها كبيرى * ويقترن نبيرا *–فيوجن التجارة والنقل كعنصر سلبي. هذه النتائج في اختبار التكرارات أربعة لكل زوج من اختبار البروتين (الجدول 1). لاختبار ما إذا كان يتم تنشيط انقسام-بيويد على التفاعل بين زوج البروتينات المختبرة، تابعنا النظام هو مبين في الشكل 1. تم transfected البلازميدات عابر في خط متوافق هيلا خلية تيت–نظام. كان الناجمين عن التعبير عن البروتينات الانصهار مع الدوكسي (دوكس) وحفز بيوتينيليشن عن طريق إضافة البيوتين الزائدة إلى متوسط النمو. وبعد فترة حضانة ح 20 مع دوكس والبيوتين، تفكيك الخلايا وتحليلها بواسطة النشاف الغربية باستخدام streptavidin مترافق لكشف البروتينات بيوتينيلاتيد. في خلايا الثدييات، شريطين الرئيسية هي عادة الكشف عن طريق streptavidin مترافق في العينة أونترانسفيكتيد (الشكل 3نجوم) وتتوافق مع اندوجينوسلي بيوتينيلاتيد البروتينات (mitochondrial الأرجح كاربوكسيلاسيس). هذه العصابات اثنين موجودة في جميع العينات، ويمكن استخدامها كعناصر تحكم تحميل الداخلية مريح، وبالتالي، الكشف عن البروتين التدبير المنزلي للتحكم في التحميل من البروتين تساوي مبالغ زائدة عن الحاجة. نموذجية لتجربة بيويد/سبليت-بيويد، العصابات الرئيسية الإضافية التي يمكن ملاحظتها هي البروتينات الانصهار التي حصلت على بيوتينيلاتيد المتمتعة بالحكم الذاتي. حتى لو كان ينظر إلى لا بروتين بيوتينيلاتيد أخرى، كشف بيوتينيليشن البروتينات الانصهار في هذه المرحلة الفعل يشير إلى أن تتفاعل البروتينات اختبار اثنين في الخلايا. في هذه التجربة هو مبين في الشكل 3، من الواضح أن وجود نبيرا *-البروتين الانصهار Ago2 يقترن كبيرى * الأنشطار إلى TNRC6C أو ديسير أكثر كفاءة من تركيبات المعاكس في كبيرى التي *-من إقران Ago2 إلى نبيرا * اندماج اثنين آخرين البروتينات (الشكل 3، اللوحة العلوية، مقارنة الكثافة الممرات 2-3 على الممرات 6-7). وعلاوة على ذلك، تم التفعيل محددة كما يمكن تنشيط أي من اندماج كبيرى * نبيرا *-البروتين الانصهار مراقبة التجارة والنقل إلى مستويات ملموس (الشكل 3، قارن حارات 1، 4-5 للين 8 الذي يتوافق مع الخلايا أونترانسفيكتيد). منذ في أعمالنا والبلازميدات، نبيرا * علامة حركة وكبيرى * وقد علامة علم (الشكل 2)، يمكن تحليل مستويات التعبير كل البروتين الانصهار مع الأجسام المضادة ضد هذه العلامات اثنين (الشكل 3، اللوحة السفلية). عندما يلاحظ بيوتينيليشن الناجمة عن التفاعل، ويمكن الارتقاء بالتجربة، وعزل البروتينات بيوتينيلاتيد على ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز كما هو مبين في الفقرة 4 من البروتوكول (الشكل 4). عند القيام بالعزلة في المرة الأولى، قد حللت جميع الخطوات للتنقية الغربية النشاف (الشكل 5). بشكل عام، ينبغي أن تكون ملزمة الخرز الكمية تقريبا وتقريبا أي تسرب من خلال ينبغي أن يراعي في يغسل. قبل تجهيز العينات الكتلي، نوصي بتشغيل وصمة عار غربية لضمان بيوتينيليشن التي يسببها يعمل كما هو متوقع، وأن أعرب عن البروتينات الانصهار. عدم وجود تعبير البروتينات الانصهار أما بسبب كفاءة تعداء الفقيرة أو تحريض دوكس الخاطئ. إذا أبديت البروتينات الانصهار ولكن لوحظ لا بيوتينيليشن، تحقق من إذا البيوتين الزائدة (50 ميكرومتر) أضيفت فعلا إلى المتوسط وأن البيوتين الأسهم لا تزال نشطة. عندما يتم تحليل المواد التيد في جل الملطخة بأخذ بروتين (الشكل 6)، عادة، يعمل في كاتشين حوالي 17 الفرقة الأقوى التي يتعين مراعاتها ويناظر streptavidin أحادي. كما يمكن ملاحظة الفرق المقابلة للبروتينات بيوتينيلاتيد الذاتية والبروتينات الانصهار. ونحن عادة المكوس مجال لين عينة فوق الفرقة ستريبتافيدين تصل إلى تحميل جيدا (الشكل 6). يمكن تخزينها في أنبوب 1.5 مل الفرقة قصت وإرسالها إلى مرفق الكتلي. بدلاً من ذلك، قد يكون البروتينات منضم التربسين هضم على الخرز إلى جانب streptavidin وهضم الببتيدات التيد تشكل العمود. نستخدم بشكل روتيني البرمجيات ماكسكوانت16 (باستخدام المعلمات الافتراضية معظمها وإضافة بيوتينيليشن يسين كتعديل بوستترانسلاشونال ممكنة، انظر المرجع 9 لمزيد من التفاصيل والنتائج النموذجية MS) لتحليل البيانات الخام مرض التصلب العصبي المتعدد بيرسيوس جناح17 للتحليل الإحصائي لاحقة، وكلاهما البرمجيات الحرة. عادة ما يتم تشغيل عينات في ثلاثة replicates البيولوجية. استخدام القياس الكمي خالية من التسمية، يمكن التعرف على وجه التحديد البروتينات المخصب على مراقبة الأوضاع. لتصفية اندوجينوسلي بيوتينيلاتيد البروتينات والبروتينات غير تحديداً المسماة بإنزيم البيرا *، نحن ننظر فقط البروتينات التي هي إلى حد كبير أثري أكثر يضرب من ست مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها مع ستة من البروتينات غير ذات صلة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن ننظر فقط عدد الزيارات التي هي أثرت على dataset سبليت-بيويد فيها البروتينات الانصهار نبيرا * وقد حلت محلها نبيرا *-التجارة والنقل. وقد اقترحت استراتيجيات أخرى لتحليل بيانات خاصة باستخدام النظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في خلية ثقافة (سيلك) للكمية البروتيوميات18. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد وصف استراتيجيات مختلفة لعزل مباشرة من الببتيدات بيوتينيلاتيد باستخدام متغير ستريبتافيدين مع تقارب ضعف إلى18من البيوتين، شروط شطف الخاصة باستخدام المذيبات العضوية19 أو البيوتين محددة الأجسام المضادة20،21. بينما ليس بالضرورة تؤدي إلى اكتشاف المزيد من البروتينات، تحديد مواقع بيوتينيليشن إضافة المزيد من الثقة فيما يتعلق بالطابع الخاص ليضرب وهي مفيدة عند معالجة الطوبولوجيا للتفاعل. رقم 1: نظرة عامة حول الإجراء سبليت-بيويد- البروتين 1 يتفاعل مع البروتين 2 كجزء من مجمع (أ)، أو مع البروتين 3 كجزء من “مجمع باء” للتحقيق على وجه التحديد تكوين A معقدة، يمكن تطبيق سبليت-بيويد للبروتينات 1 و 2. صورة مطياف كتلة تحت الإبداعي العموم إسناد حصة على حد سواء 3.0 Unported ترخيص وتم تحميلها من https://commons.wikimedia.org مع اسم الملف ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: شرائط التعبير من والبلازميدات سبليت-بيويد- ونحن نقدم والبلازميدات الأربعة للسماح باختبار كافة تركيبات من نبيرا * وكبيرى * البروتينات الانصهار. تتوفر هذه البلازميدات وخرائط كاملة في addgene.org تحت الأرقام المشار إليها. والبلازميدات عنصر تيت مراعية (7 x تيتو) وتحتاج إلى استخدامها في خلية خط متوافق مع نظام التعبير تيت. أيضا ملاحظة أن تنصهر في جميع والبلازميدات Orf فكبب و FRB إلى نبيرا * كبيرا * وشظايا على التوالي. تتفاعل هذه البروتينات اثنين فقط حضور ربمسن وبالتالي يمكن استخدامها في والبلازميدات لاختبار النظام بسرعة في وجود أو عدم وجود هذه المواد الكيميائية9. مواقع التقييد المشار إليها فريدة من نوعها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: وصمة عار “الغربية نموذجية” لتجربة سبليت-بيويد- اللوحة العلوية: الكشف عن البروتينات بيوتينيلاتيد مع ستريبتافيدين المسمى فلوريسسينتلي. لوحة أقل: الكشف عن البروتينات الانصهار مع الأجسام المضادة حركة والمضادة العلم. تم اختبار أزواج اثنين من البروتينات: Ago2/TNRC6C و Ago2/ديسير. في الممرات 2 و 3، تم إلحاق Ago2 إلى جزء كبيرا *. في حارات 6 و 7، تم إلحاق Ago2 إلى الجزء نبيرا *. لا توجد إشارة هامة قد لوحظ عند أي من البروتينات الثلاثة كانوا جنبا إلى جنب مع نبيرا *-التجارة والنقل (الممرات 1، 4-5). تشير النجوم إلى العصابات المقابلة للبروتينات بيوتينيلاتيد التي يمكن أن تكون بمثابة الضوابط الداخلية تحميل اندوجينوسلي. وهذا الرقم مقتبس من الشكل 5B من شوب et al. 9 تحت رخصة “الإبداعي العموم الإسناد 4.0 الدولية”. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4: نظرة عامة حول الإجراء المنسدلة ستريبتافيدين. يصور الخطوات الرئيسية لعزل البروتينات بيوتينيلاتيد لتحليل الطيف الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 5: وصمة عار “الغربية نموذجية” لتجربة المنسدلة ستريبتافيدين. يساوي حجم كل عينة المشار إليه تم تحميلها على الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام. وبعد النشاف الغربية، تم اكتشاف البروتينات بيوتينيلاتيد مع ستريبتافيدين إلى جانب برنامج الصحة الإنجابية. عصابات تناظر نبيرا *-TNRC6C وكبيرى–يتم الإشارة إلى Ago2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 6: جل البروتين الملطخة “أخذ نموذجي” لتحليل الطيف الكتلي. كان حملت على جل بروتين الجاهزة العينة التيد من ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز وتشغيل حتى ترحيل العينة 2-3 سم. الفرقة الرئيسية ينظر في كاتشين حوالي 17 ستريبتافيدين. اقتطعت منطقة مباشرة أعلاه أن الفرقة وأرسل إلى مرفق الكتلي. عصابات تناظر نبيرا *-TNRC6C وكبيرى–يتم الإشارة إلى Ago2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- نموذج تعداء حالة اختبار 1 نبيرا *-protein1/كبيرى *–protein2 2 كبيرى *-protein1/نبيرا *–protein2 3 نبيرا *-التجارة والنقل/كبيرا *–protein1 4 نبيرا *-التجارة والنقل/كبيرى *–protein2 5 لا تعداء الجدول 1: عادة اختبار الشروط عند تطبيق انقسام-بيويد على اثنين من البروتينات. الدليل التمهيدي للتسلسل التسلسل كاسيت 1 عكس التمهيدي (الانصهار كبيرى *) تاتاكتتكتاجاجاتاجاك كاسيت 2 عكس التمهيدي (الانصهار نبيرا *) جتجتتجتككااكتكاتك الجدول 2: تسلسل كبسولة تفجير والبلازميدات سبليت-بيويد.

Discussion

يصف الإجراء المبين كيفية استنساخ جينات فائدة في سبليت-بيويد البلازميدات وكيفية اختبار بيوتينيليشن الناجمة عن التفاعل وكيفية عزل البروتينات بيوتينيلاتيد لتحليل الطيف الكتلي. يصف لنا هنا إجراء يستند تعداء عابرة. في حين يمكن ضبطها على التعبير عن البروتينات الانصهار بمقدار دوكس إضافة إلى المتوسط، تعداء عابر قد يؤدي إلى التعبير البروتين غير متجانسة مع بعض الخلايا بشكل صارخ أوفيريكسبريس البروتينات الانصهار إذا ما قورنت الذاتية النظراء. وهذا قد يؤدي إلى تشوهات إينتيراكتوميس المقابلة وإلى PPI التي لا تعكس بدقة التفاعلات التي تنطوي على البروتينات الذاتية. وهكذا يستحسن عموما لتشييد خطوط الخلايا مستقرة بعد إثبات سبليت-بيويد مع نظام عابر. والبلازميدات متوافقة مع نظام اقترانها بوساطة حزب العمل الفيجي وكلا الجينات الفائدة بموجب اللائحة من نفس العنصر تيت المراعية. إذا لزم الأمر، وعند استخدامها مع خلايا الثدييات متوافقة، أنها تسمح بإنشاء خطوط الخلايا إيندوسيبلي مستقرة سهلة. على سبيل المثال، نحن نستخدم الخط هيلا-EM2-11 الذي يعبر عن المنشط المنشط التتراسيكلين النسخ رتا وموضع الجينوم استهدافها فريد الذي يمكن أن يكون التعبير الجيني بوساطة التتراسيكلين محكم التنظيم12. استخدام هذا الخط الخليوي واقترانها بوساطة حزب العمل الفيجي، يمكن الحصول على خطوط الخلية المستقرة التي تحتوي على نسخة واحدة فقط من التحوير غضون أسبوعين-ثلاثة أسابيع. بدلاً من ذلك، واحد يمكن أيضا استخدام تقنيات التحرير الجينوم الحالي ﻹدخال البيرا * الشظايا في المكاني الجينوم الأصلي للجينات للفائدة.

كما هو الحال في أي تحليل يعتمد على علامات بروتين، يحتاج المرء للنظر إذا كان الانصهار البروتينات الناتجة وظيفية. اختبار البيانات المتاحة التي كانت معلم البروتينات للفائدة (على سبيل المثال مع التجارة والنقل للتصوير الدراسات) ووظيفيا مفيداً أن يقرر إذا كان ينبغي أن تكون الشظايا البيرا * المستنسخة المنبع أو المصب الجينات للفائدة. إذا كان لا من هذه البيانات متاحة، ينبغي اختبار واحد ن لا شفاء منه أو ج-شفاء معلم البروتينات في مقايسة وظيفية. على سبيل المثال، يمكن اختبار نشاط البروتينات الانصهار في خط خلية التي البروتين الذاتية تم طرقت السحب ومقارنة بالحالة نوع البرية. إذا تحمل البروتينات التي تهم كلا الطرفي ن وج العلامات، على حد سواء وينبغي اختبار. التوجه للبروتين الانصهار في تجارب بيويد، في الواقع، يمكن أن تؤثر كفاءة وسم22. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد لاحظنا أنه عند تطبيق انقسام-بيويد على زوج من البروتينات، التي من البروتينات هما يتم إلحاق إلى أما نبيرا * أو كبيرى * تجزئ أيضا تأثير كفاءة وسم9. في والبلازميدات سبليت–بيويد، 16 من الأحماض الأمينية طويلة جليكاين/سيرين linkers الغنية اقتران البروتينات ذات الاهتمام للشظايا البيرا * أخذت من آخر محكمة التحكيم الدائمة23 وعملت لنا لجميع البروتينات المتفاعلة اختبرناها حتى الآن. ومع ذلك، ينبغي النظر أن بعض أزواج البروتين قد تعمل على نحو أفضل مع linkers أقصر أو أطول. ووصف المجموعة بولين24من ملاحظة أخيرة، مقايسة أخرى. في هذا التحليل، البيرا * يتم تقسيم في موقع آخر (e140 من/Q141) من بلدنا (E256/G257). لدينا اختبار كلا سبليت-بيويد النكهات-جنب ووجدت أن E256/G257، المبينة في هذا البروتوكول، ويؤدي إلى إعادة تنشيط أقوى عندما يقترن باثنين من البروتينات المتفاعلة9.

عيب عام واحد من هذا الأسلوب هو بطء وضع العلامات. نموذجياً، ح 6 إلى 24 حضانة الوقت مع البيوتين من الضروري الحصول على بيوتينيليشن ملموس6، النافية لاستخدام هذا الأسلوب لدراسة إعادة عرض ديناميكية من البروتين المجمعات. بينما هذا التحليل يتناول جزئيا هذا التحذير كما يتم تفعيلها فقط عندما تتفاعل البروتينات اثنين، بطء وسم يحول دون استخدامها لدراسة استجابة للعمليات الحيوية جداً، أو لتحليل البروتينات لم تدم طويلاً. البيروكسيديز هندسيا المعروف APEX2 لتعزيز كفاءة وسم البروتينات الدانية داخل 1 دقيقة3. قد تعالج محكمة التحكيم الدائمة استناداً إلى APEX2 وبذلك القيود المفروضة على بطء وضع العلامات لفحوصات المستمدة من بيويد. ووصف دراسة إثبات لمبدأ هذه تقسيم APEX2 مقايسة25. ومع ذلك، رغم بروتين هوموديميريزينج تمت بنجاح بيوتينيلاتيد، عما إذا كان يمكن أيضا استخدامها في التحليل لتسمية وتحديد البروتينات التي تجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة لا يزال إلى إثبات. ومؤخرا جداً، استخدمت التطور الموجه لإنشاء توربويد ومينيتوربو، نوعين مختلفين من البيرا * مع تعزيز النشاط التي تسمح للإطارات الزمنية التوسيم أقصر بكثير، وصولاً إلى 10 دقيقة26. سيتم تكييف سبليت-بيويد لهذه المتغيرات الجديدة مواصلة توسيع نطاق استخدام هذا الأسلوب إلى حقل أوسع للتطبيقات.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من مجلس “البحوث الألمانية” (DFG) من خلال مبادرة التفوق الألماني (سيلنيتوركس DFG-EXC 81)، وتمويل جزئي بمركز البحوث التعاونية SFB638.

Materials

Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Tags

Split-BioIDProteomic AnalysisProtein ComplexesNative Cellular EnvironmentProtein Fragment Complementation AssayProximity-dependent Protein BiotinylationCell BiologyMass Spectrometric AnalysisStreptavidin PulldownProtein Complexes RemodelingContext-specific Protein Complexes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image