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생물학

Utilisation des anticorps Anti-phospho-girdin pour visualiser la touffe Intestinal cellules de souris flottante jéjunum Cryosections

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/57475
, , , , , , ,
1Division of Perinatology, Institute for Developmental Research,Aichi Human Service Center, 2Surgery Department,Anjo Kosei Hospital, 3Department of Pathology,Nagoya University Graduate School of Medicine

Summary

Kuga et coll. a découvert que des anticorps spécifiques contre l’actine liaison protéine girdin phosphorylé en tyrosine 1798 (pY1798)-État de phosphorylation peuvent être utilisés pour étiqueter des cellules touffe (TCs). Ce protocole permet la visualisation robuste de TCs en utilisant la coloration par immunofluorescence des cryosections jéjunum flottant avec des anticorps pY1798.

Abstract

Le girdin de protéine liaison actine est une protéine cytosolique qui est requise pour l’actine remodelage pour déclencher la migration cellulaire dans divers tissus. Girdin est phosphorylé par les récepteurs et les tyrosines kinases récepteurs à tyrosine 1798. Omori et coll. développé site – et la phosphorylation statut des anticorps spécifiques contre girdin humaine à tyrosine-1798 (pY1798), qui se lient spécifiquement à 1798-tyrosine phosphorylées, mais pas au lieu de tyrosine-1798. pY1798 anticorps ont été utilisés pour étiqueter spécifiquement les cellules de touffe (TCs) qui sont présentes dans des tissus gastro-intestinaux chez les mammifères, mais la fonction de ces cellules n’est pas claire. Ce protocole permet la visualisation robuste de TCs dans le jéjunum à l’aide d’immunofluorescence et anticorps pY1798. Afin d’assurer avec succès et simple visualisation de TC, ce protocole inclut deux techniques histologiques : production des cryosections flottantes de tissu rempli de gélatine jéjunum et recherche d’antigène de basse température à 50 ° C pendant 3 h. remplissage du jéjunum avec gélatine maintient la forme des sections flottant librement dans l’ensemble de la procédure de marquage, recherche d’antigène de basse température, assure signaux robustes d’utilisation réussie de ce protocole se traduit par pY1798 coloration du TCs distribués de pointe de villosités à TCs. crypte. Teinté de TCs ont un soma en forme de bobine et signaux fluorescents se condensent à la pointe de lumière, ce qui correspond à la saillie « touffe ». Phalloïdine coloration colocalisé avec TCs pY1798 séropositifs à la bordure en brosse épaissies et correspond à une masse de radicelles s’étendant de la touffe de TC. Ce protocole pourrait servir à examiner les TCs dans biopsie humains prélevés avec des endoscopes gastro-intestinaux. En outre, TCs ont été signalés récemment de s’accumuler après l’infection de parasite chez les souris, ce qui suggère que ce protocole pourrait avoir des applications pour le diagnostic des infections de parasites dans l’intestin humain.

Introduction

Cellules de touffe (TCs) sont des constituants mineurs dispersés de l’épithélium digestif qui se caractérisent par des touffes apicales et somas en forme de bobine1. Bien que les TCs ont été d’abord décrite en 19562, TC fonction reste peu claire, en partie en raison du manque de marqueurs fiables de TC.

Enomoto et al. d’abord caractérisé la protéine de liaison de l’actine girdin3, qui s’exprime dans le système nerveux, ainsi que dans les tissus tels que les vaisseaux sanguins, les valvules cardiaques, des tendons et muscle squelettique4non-neurale. Souris avec ablation génétique de girdin affichent un retard de croissance et des anomalies de cerveau multiple4,5,6. Pendant ce temps, perte de fonction mutation dans girdin humaine est associée à une encéphalopathie progressive, un retard sévère et précoce apparition des crises d’épilepsie7.

En 2011, Lin et coll. identifié dynamique phosphorylation de girdin à tyrosine 1798 médiée par des kinases de tyrosine comme EGFR et Src8. Ils ont également montré que phosphorylés girdin est requis pour actine remodelage pour déclencher la cellule migration8. Omori et coll. développé site – et phosphorylation statut spécifique anticorps contre girdin humaine phosphorylé en tyrosine 1798 (anticorps pY1798) suivant le protocole de Goto et validé les anticorps à l’aide de mutagénèse dirigée de vecteurs d’expression comptable pleine longueur girdin9,10. En 2017, Kuga et al. a rapporté que pY1798 des étiquettes de TCs avec grande spécificité et une sensibilité élevée1. Les anticorps pY1798 se sont révélés supérieurs aux marqueurs de TC précédentes basées sur les excellentes propriétés de coloration qui a révélé la forme de cellules entières, y compris la caractéristique « touffe » sur la pointe de lumière, encore le rôle biologique de girdin et phospho-girdin en TC fonction est restée peu clair1.

La méthode décrite dans la présente étude consiste immunofluorescence souillant, une technique histologique pour marquer une protéine spécifique sur le tissu à l’aide d’un anticorps primaire dirigé contre une protéine cible et un anticorps secondaire conjugué fluorescence contre les primaires anticorps. Cette méthode vise à permettre aux chercheurs ayant une expérience limitée histologique d’obtenir des images de haute qualité TC. Ce protocole utilise des cryosections flottantes qui évitent la nécessité des cryosections montés sur glissière, ou section de paraffine. Toutefois, les sections flottantes sont fragiles en raison de l’absence de prise en charge d’une lame de verre et l’épaisseur de coupe peut diminuer la perméabilité des anticorps. Ce protocole comprend deux approches qui surmontent ces questions : 1) remplissant la lumière du jéjunum ensemble avec de la gélatine pour préserver la morphologie des sections flottant librement dans l’ensemble les méthodes de coloration et 2) l’utilisation de la recherche d’antigène de basse température à intensifier les signaux pY1798.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme de l’Institut de recherche de développement, centre de Service de l’homme Aichi et animalier (numéro de demande : M-03). 1. les préparatifs Préparer 10 litres de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 32,27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g de NaH2PO4·2H2O, 80,0 g de NaCl ajouté à l’eau ultrapure pour un volume final de 10 L. magasin solution à température ambiante (RT). Préparation de 200 mL de PBS-t : 200 mL de PBS à l’étape 1.1 avec 100 µL de polyoxyethylene(10) octylphényle éther à une concentration finale de 0,05 % (dilution). Magasin à température ambiante. Si vous portez des gants et des lunettes de protection, préparer 50 mL de 15 % de saccharose en solution de formol neutre 10 % tamponné : 7,5 g de saccharose ajouté 10 % tamponné solution de formol neutre (Table des matières) à un volume final de 50 mL. Magasin à température ambiante.ATTENTION : Inhalation et/ou oculaire/cutanée en contact avec le formaldéhyde en solution de formol neutre 10 % mis en mémoire tamponné peut être dangereux. Manipuler avec précaution. Préparer le 1,5 mL de solution mère conjugué 200 unités/mL colorant fluorescent phalloïdine : conjugué de colorant fluorescent phalloïdine (300 unités dans 1 flacon, lyophilisées solides, les longueurs d’onde d’excitation et d’émission : 581 nm et 609 nm, respectivement) suspendu dans 1,5 mL de méthanol. Solution de boutique dans l’obscurité à-20 ° C. Préparer 5 mg / mL 4′, 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) de solution mère : 10 mg de DAPI dans 2 mL de N, N-diméthylformamide (DMF). Solution de boutique dans l’obscurité à-20 ° C. Préparer 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS : 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Conserver à 4 ° C. Retirer l’embout biseauté d’une aiguille de calibre 18 droite à l’aide d’une pince et pincez l’extrémité pincée avec un pincher dans un sens de la longueur pour laisser le liquide s’écouler à travers la lumière de l’aiguille (Figure 1 a1).Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. 2. animale Dissection et l’isolement du jéjunum Fixation de la perfusion d’une souris Porter des gants et travailler dans un endroit bien aéré. Préparer un bol de verre de 100 mL, 10 % tamponnée solution de formol neutre, instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces), un plateau métallique, 6-0 en nylon coupe des sutures, une aiguille droite de calibre 18, préparée comme dans 1.7, une aiguille ailée de calibre 22, une seringue de 20 mL. 20 mL de solution de formol neutre 10 % mis en mémoire tamponné de charge de la carafe en verre dans la seringue de 20 mL et fixer l’aiguille ailé de calibre 22 à la sortie. Préparer la gélatine liquide en ajoutant 1 g de poudre de gélatine à 20 mL de PBS (gélatine finale de 5 %) dans un tube à centrifuger de 50 mL. Après le trempage au RT pendant 15 min, incuber à 50 ° C au bain-marie pendant 15 minutes sans agiter. Brièvement, vortex et incuber à 50 ° C pendant 15 min jusqu’à dissolution complète de la gélatine. Maintenir le tube à RT jusqu’à utilisation. Euthanasier une souris adulte par dislocation cervicale. Placez la souris de l’étape 2.1.6 sur un plateau métallique et faire une petite incision sur la peau à travers le cartilage Ensiformes, à l’aide d’instruments chirurgicaux. Développez l’incision avec les deux mains pour exposer les régions thoraciques et abdominales. Ouvrir le péritoine pour exposer le diaphragme et ouvrez le diaphragme des deux côtés. Couper la cage thoracique, le long des lignes axillaires antérieures des deux côtés, puis enlever la paroi thoracique par une coupe dans le sens transversal à la position du thymus pour exposer le cœur. Faire une petite incision sur le pavillon de l’oreillette droite pour drainer le sang et insérer une aiguille ailée de calibre 22 dans l’apex du ventricule gauche. Poussez le piston pour perfuse les tissus avec une solution de formol neutre 10 % mis en mémoire tamponné. Après avoir exposé les organes dans le bassin, couper l’extrémité du rectum de l’anus et séparer les intestins du corps en coupant le mésentère. Pour isoler le jéjunum, couper les intestins à 4 cm du côté anal de l’antre gastrique. Jeter la moitié anale de l’intestin grêle restant. Inciser le jéjunum en deux pour faciliter la procédure de rinçage. Charge 20 mL de 10 % mis en mémoire tampon de la solution de formol neutre dans la seringue de 20 mL et fixer l’aiguille droite de calibre 18, préparé à l’étape 1.7 à la sortie. Injecter la solution de formol neutre 10 % tamponnée d’un bout du jéjunum coupé afin d’éliminer le contenu intestinal et de fixer la surface de lumen de l’intestin (Figure 1 a2). Laver la lumière du tube digestif en injectant des PBS comme décrit à l’étape 2.1.15. Rincer la gélatine liquide dans la lumière intestinale, tel que décrit à l’étape 2.1.15 pour remplacer les PBS avec gélatine liquide. Fermer une des extrémités du jéjunum écrêté par ligature de suture à l’aide d’un nylon de 6-0 Coupe suture, remplir le jéjunum avec gélatine liquide et fermer l’extrémité opposée par ligature de suture (Figure 1 a3). Ajouter quatre nœuds de suture pour s’adapter à une section en forme de saucisse jéjunum à la partie déprimée d’un cryomold (Figure 1 a4).NOTE : Pour cryomolds avec un 20 x 25 mm x 5 mm déprimée de l’article, une section de type saucisse jéjunum ~ 20 mm est préférable. Faites tremper les tissus dans 50 mL de 15 % de saccharose en solution de formol neutre 10 % mis en mémoire tamponné pendant la nuit à 4 ° C.Remarque : Ces étapes s’assurer cryoprotection de saccharose et protéine de fixation par formol de gélatine et de tissus. Formol-gélatinisée gélatine ne fond pas à la droite, tandis que le fond de gélatine gélatinisé non fixée à 4 ° C à température ambiante. 3. Replacez la congélation des tissus remplis de gélatine jéjunum En coupant le jéjunum aux nœuds de suture, trois morceaux de jéjunum de saucisse-comme avec les deux extrémités ligaturées est obtenues (Figure 1 a4). Alignez les morceaux de saucisse-comme dans un cryomold pour l’ajout d’incorporation composé pour la préparation des échantillons de tissus congelés. Composant logiciel enfichable geler le cryomold dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Magasin cryomolds à-80 ° CRemarque : Le protocole peut être suspendu ici. 4. immunofluorescence de touffe cellules utilisant des Cryosections flottantes Cryosectioning Régler la température de chambre cryostat (CT) et température de l’objet (OT) à-22 ° C. Place les tissus congelés bloquer dans un cryomold dans la chambre du cryostat pendant au moins 15 minutes. Ajouter 3 mL de PBS à une boîte de Petri de 35 mm. Retirer le bloc de tissus congelés de la cryomold et coupez le bloc en deux avec une lame de rasoir pour exposer la section transversale du jéjunum. Monter une moitié du bloc sur un mandrin (un adaptateur cryostat) à l’article le plan de coupe avec la lame de rasoir. Section du jéjunum rempli de gélatine en 30 sections µm d’épaisseur. Utilisation congelés pinces pour transférer doucement les sections dans la boîte de Petri 35 mm préparé à l’étape 4.1.2 (Figure 2 bà droite). Application des anticorps primaires Laver les sections flottant librement dans la boîte de Petri 35 mm 3 fois pendant 5 min chacun avec 3 mL de PBS-T avec la secousse légère sur un agitateur réciproque (environ 36 fois / min). Préparer la solution de l’antigène : 0,3 mL de concentré de solution d’extraction antigène (Table des matières) à 2,7 mL d’eau ultrapure. Ajouter 3 mL de solution de l’antigène pour le 35 mm boîte de Petri contenant des sections flottantes. Fermer le couvercle, sceller l’écart entre le plat et le couvercle avec une bande de ruban adhésif en vinyle et incuber à 50 ° C dans une étuve à hybridation pendant 3 h sans agitation. Retirer le plat de l’incubateur et cool à la droite pendant 20 min. Après avoir enlevé le ruban adhésif en vinyle, lavez les sections 3 fois pendant 5 min avec 3 mL de PBS-T et en secouant la douce. Aspirer le PBS-T et ajouter 5 gouttes de solution de saturation (Table des matières) sur les sections. Incuber 5 min sous agitation légère à RT. Préparer la solution d’anticorps primaire : 495 µL de 5 % de BSA dans du PBS 5 µl de phospho-Y1798 girdin (pY1798) anticorps (Table des matières). Ajouter 500 µL de solution d’anticorps primaire sur les sections (la solution de blocage n’a pas besoin d’être retiré). Placer le plat dans une chambre d’incubation humidifié et incuber une nuit à 4 ° C sous agitation légère.Remarque : L’incubation pendant la nuit peut être prolongée jusqu’à trois nuits. Application des anticorps secondaires Laver les sections 3 fois pendant 5 min dans 3 mL de PBS-T avec agitation douce. Préparer la solution diluée de DAPI : 2 µL de la solution mère de DAPI (étape 1.5), 998 µL de PBS. Faire la solution d’anticorps secondaire : 476 µL de 5 % de BSA dans du PBS, 10,5 µL de solution diluée de DAPI, 12,5 µL de solution mère conjugué de colorant fluorescent phalloïdine, 1 µL de conjugué de teinture chèvre anti-lapin IgG-fluorescent (longueur d’onde : excitation 496 nm, émission 520 nm). Après aspiration du PBS-T, appliquer la solution d’anticorps secondaire et incuber dans une chambre d’incubation blindé léger à ta pendant 30 min avec une agitation douce. Laver les sections 3 fois pendant 5 min avec 3 mL de PBS-T et en secouant la douce. Après le lavage final, supprimez le PBS-T et remplacez-les par 3 mL de PBS manque polyoxyethylene(10) octylphényle éther. Placer la capsule à un microscope stéréoscopique. Place 200 µL de PBS dans une goutte sur le centre d’une section de jéjunum un verre blanc MAS diapositive et le transfert du plat dans la goutte à l’aide d’une pointe de pipette P200. Après ajustement de l’alignement de section sous le microscope stéréoscopique, aspirer tous les PBS restantes entourant la section. Ajouter 20 µL de milieux de montage aqueux et placez une lamelle de 20 x 20 mm au sommet des médias. Immédiatement, sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec support de montage à base de xylène. Placer la lame sur une mappe en bois et laisser le support de montage à base de xylène à se solidifier à RT pendant 2-3 h.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Après que le support de montage à base de xylène se solidifie, les diapositives peuvent être conservés pendant 2 à 3 semaines dans une boîte de blindé léger glissement à température ambiante. 5. confocal Microscopy Mettre huile d’immersion sur l’objectif X 63 d’un microscope confocal. Baissez la lamelle couvre-objet-lame et placer la lame sur la scène. Numériser les images de TC acquis à laser longueur d’onde 405 et 488 555 nm et enregistrer les images au format tiff (.tiff).NOTE : Choisir un ensemble de filtre de détection qui est approprié pour les colorants de fluorescence (c.-à-d., les maxima excitation/émission : 358/461 nm, 490/525 et 590/617).

Representative Results

Gélatine-remplissage du jéjunum Une procédure typique pour le remplissage de jéjunum de souris avec de la gélatine s’affiche (Figure 1 a), comme sont les avantages de gélatine-remplissage (Figure 1 b). En bref, la pointe biseautée d’une aiguille droite de calibre 18 a été supprimée pour se protéger contre la perforation de la paroi intestinale (Figure 1 a,1). Remplissage de la gélatine a été réalisé en utilisant 10 % solution de formol neutre injectée d’une extrémité d’une section de jéjunum écrêté pour vider l’intestin et de fixer la surface de lumen de l’intestin (Figure 1 a2) tamponnée avant le remplissage avec de la gélatine liquide ( ) Figure 1 a3). Les morceaux de saucisse-like qui en résulte (Figure 1 a4) ont été intégrés, congelés et sectionnés transversalement en 30 µm d’épaisseur tranches dans un cryostat. En l’absence de gélatine remplissage, jéjunale sections ont tendance à plier, ce qui permet des villosités se balancer vers l’arrière (Figure 1 bà gauche). Remplissage de gélatine préserve la disque-forme ronde des sections et maintient un positionnement vertical des villosités (Figure 1 bà droite). Les images montrent clairement la prestation offerte par gélatine de remplissage dans la préservation de la morphologie des sections de jéjunum flottant. Imagerie réussie des cellules intestinales touffe pY1798 anticorps peuvent être appliquées aux techniques de l’immuno-coloration variable, y compris dot-blot, western blot, la coloration de la section de paraffine, dégel-monté cryosection coloration ou flottante cryosection coloration1,9. Dans ce protocole, nous nous sommes concentrés sur des cryosections flottantes pour la fluorescence souillure du TCs dans le jéjunum de souris en utilisant des anticorps pY1798, phalloïdine et DAPI coloration afin de démontrer les caractéristiques structurelles du TCs1. En général, TCs sont dispersés à raison d’environ un TC/100 cellules épithéliales de pointe de villosités à crypte1. Les résultats représentatifs montrent que pY1798 délimite reproductible TCs entières, y compris la membrane, cytoplasme de soma en forme de bobine et la pointe fortement teintée de lumière, où la condensation solide signal correspond à la saillie « touffe » d’un TC1 ()Figure 2 a-2 b). En attendant, la phalloïdine est un phallotoxin, une famille toxique trouve bicycliques du champignon Amanita phalloideset a une affinité élevée pour les filaments d’actine (actine-F), qui est présente dans les microvillosités qui forment la bordure en brosse intestinale 11. la phalloïdine reproductible et une place importante marque la bordure en brosse épaisse qui correspond à une masse de radicelles s’étendant de la touffe1. Ainsi, la co-localisation cohérente des signaux de pY1798 (en forme de bobine soma, condensation de signal à la pointe de lumière) avec la bordure en brosse de la phalloïdine-positif en évidence épaissie démontre que ce protocole précise avec succès TCs indépendamment du qu’ils soient situés sur une ()Figure 2 a) des villosités ou dans une crypte ()Figure 2 b). Recherche d’antigène de basse température est efficace pour la coloration des sections flottantes Recherche d’antigène axée sur la chaleur entre 95 et 99 ° C est largement utilisé pour l’analyse des sections de paraffine et cryosections monté sur glissière. Toutefois, appliquant cette approche aux sections flottantes sans causer de dommages est difficile parce que ces sections sont généralement plus fragiles que les sections montées sur lame qui sont pris en charge par la diapositive12. Depuis la recherche d’antigène de basse température (50 ° C pendant 3 h) à l’aide d’un bain d’eau n’affecte pas la morphologie des sections jéjunum flottant librement dans des expériences préliminaires, nous avons évalué l’efficacité objective de recherche d’antigène dans un blind test, qui statistiquement, a confirmé l’efficacité de la recherche d’antigène de basse températureFigure 3) (). Figure 1 : Remplissage de gélatine des sections de jéjunum de préservation morphologique des cryosectionsPhotographies de (A) des procédures de remplissage intraluminale de jéjunum de souris avec de la gélatine. (A1) La pointe biseautée d’une aiguille droite de calibre 18 a été supprimée pour éviter la perforation de la paroi intestinale. (A2) Solution de formol neutre tamponné (10 %) a été injectée dans une extrémité du jéjunum écrêté à vider le contenu intestinal et fixer la surface de lumière du tube digestif. (A3) Jéjunum écrêté rempli de gélatine liquide et les deux extrémités ligaturées à l’aide d’un 6-0 en nylon suture (flèches noires). (A4) Quatre plus suture noeuds (flèches blanches) placé entre le préexistant de noeuds de suture (flèches noires) ont donné trois pièces plus courtes. Le tissu sera ensuite séparé en trois morceaux de saucisse ressemblant à deux positions indiquées (flèches blanches). (B) les effets bénéfiques de gélatine-remplissage sur la morphologie des cryosection flottant. Sans remplissage de gélatine, sections ont tendance à se plisser, permettant les villosités se balancer facilement vers l’arrière (gauche); avec remplissage de gélatine, une section de µm d’épaisseur 30 maintient une forme de disque et la position verticale des villosités est préservé (à droite). Des images ont été photographiés à l’aide de contraste interférentiel différentiel Nomarski. Échelle de barres, de 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Images de fluorescence Représentant touffe intestinale des cellules de sourisImages confocal fluorescence du TCs sur un des villosités (A) ou dans une crypte (B), dans les sections de jéjunum flottant souris colorées avec in situ et phosphorylation à statut particulier des anticorps contre girdin phosphorylé en tyrosine (1798 pY1798, vert, optimale excitation/émission longueurs d’onde 490/525 nm), la phalloïdine (rouge, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, blue, 358/461 nm). La zone délimitée par les cases blanches dans les images de faible grossissement (échelle bars, 50 µm) est développé sur la droite (échelle bars, 10 µm). anticorps pY1798 tachent reproductible TCs, peu importe l’emplacement (sur des villosités (A), ou dans une crypte (B)), présent à la lumière pointe (flèches), membrane et cytoplasme du soma TC en forme de bobine de coloration. Une bordure en brosse épaissie en bonne place dans la phalloïdine coloration (pointes de flèches) est un autre signe distinctif du TCs. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Recherche d’antigène froid améliore pY1798 immunofluorescenceDeux groupes de procédures expérimentales ont été comparées pour confirmer l’efficacité de la recherche d’antigène de basse température. Sections de jéjunum flottant (30 µm épais, n = 13) d’un seul bloc congelé ont été divisés en deux groupes et des sections de chaque groupe sont colorées selon le protocole complet ou le même protocole sans recherche d’antigène de basse température (étape 4.2.2). Après coloration, les sections étaient montées sur des diapositives individuelles portant les numéros de groupe, et l’étiquetage sur chaque diapositive a été recouvert de ruban adhésif. Toutes les diapositives ont été mélangées, étiquetées avec nouveaux numéros sur le ruban adhésif et observés en microscopie de fluorescence à travers un filtre FITC. Comptages totaux des visible CT pY1798 séropositifs ont fait la moyenne de chaque groupe et ont été affichées dans un graphique à barres (moyenne ± écart-type). Un t-test bilatéral a été réalisé pour comparer les comtes moyennes entre les deux groupes. Valeur de P inférieure à 0,05 était considérés comme statistiquement significatifs. Recherche d’antigène de basse température a considérablement amélioré l’efficacité des pY1798-immunofluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole a été conçu pour permettre aux chercheurs sans expérience histologie d’obtenir des images fiables des cellules (SDC) de la touffe. Ce protocole a trois points critiques : 1) l’utilisation du site – et phosphorylation lapin de statut spécifique anticorps polyclonaux dirigés contre girdin humaine phosphorylé en tyrosine 1798 (anticorps pY1798) obtenus à partir d’une société spécifique ( Laboratoires Immuno-Biological = société X) ; 2) remplissage gélatine du jéjunum ; et 3) recherche d’antigène de basse température. Au sens large, des anticorps spécifiques statut phosphorylation peuvent être qualifiées de modification spécifique des anticorps qui reconnaissent un certain type de modification post-traductionnelle (p. ex. l’acétylation, méthylation ou phosphorylation) d’un protéine à un résidu d’acide aminé spécifique. Omori et al. et l’entreprise X conjointement généré pY1798 anticorps en immunisant des lapins avec peptide phosphorylé et purifier les anticorps qui en résulte, chromatographie en phase solide avec un peptide lieu suite à la méthode9, du Goto 10. pY1798 anticorps ont été intensivement validés avec des analyses in vitro la phosphorylation en utilisant la pleine longueur vecteurs d’expression girdin humaine avec/sans une mutation ponctuelle à la tyrosine 17989. Par la suite, Kuga et coll. a constaté que les anticorps pY1798 de la société X sont un marqueur spécifique et sensible d’intestinale TCs1. Inclusion des anticorps pY1798 de la société X est donc un point critique dans le présent protocole.

Gélatine contient collagène extraite des tissus animaux et a longtemps été utilisé pour incorporer des échantillons de tissus pour les études histochimiques utilisant des cryosections13. Gélatine de faible point de fusion, qui est gélatinisée à 4 ° C mais fond à température ambiante, a commencé à être appliqué pour éviter les effets néfastes de la chaleur nécessaire pour maintenir les feuilles de gélatine à l’état liquide au cours de l’incorporation de14. Dans ce protocole, gélatine faible point de fusion de poudre de gélatine qui gélatinise à 4 ° C et fond à RT a été utilisé pour préserver la morphologie des cryosections transversales de jéjunum de souris. Lorsque cette gélatine a été utilisée pour remplir complètement le jéjunum, échantillons étaient ensuite fixés au formol pour atteindre la gélatinisation irréversible. Recherche d’antigène induite par la chaleur est une méthode efficace pour exposer des antigènes qui sont masqués par l’aldéhyde-contenant fixatifs12. Cependant, les températures élevées (95-99 ° C pendant 30 min) couramment utilisés pour l’analyse des sections de paraffine peuvent endommager la morphologie de la complexe tissu/gélatine. Ici nous avons utilisé la recherche d’antigène de basse température (50 ° C pendant 3 h) qui permet la recherche d’antigène et conservation de la morphologie des tissus.

anticorps pY1798 peuvent étiqueter TCs, non seulement dans le jéjunum de souris, mais aussi dans plusieurs organes (estomac, iléon, le côlon et vésicule biliaire) et de souris et les humains1. Cependant, parce que les signaux de pY1798 dans les tissus non fixées de n’importe quel tissu vont rapidement se dégrader, ce protocole inclut injection de formol dans la lumière du jéjunum (étape 2.1.15., 1 a Figure2).

Il y a des limites associées à l’épaisseur des cryosections flottantes. Bien que minces cryosections peut être avantageuses en termes de transparence pour la microscopie, la minceur rend ces sections physiquement vulnérables. En revanche, épaisses cryosections sont solides physiquement, mais a plus faible perméabilité d’anticorps dans la section. Dans ce protocole, 30 µm d’épaisseur sections ont été utilisées qui ont été physiquement stable et perméable aux anticorps. Bien que cette méthode a été conçue pour les chercheurs sans une vaste expérience en histologie, si le protocole cesse de fonctionner, la coloration triple pY1798/villin/DAPI de paraffine sections semblable à celle utilisée par Kuga et al. pouvaient être réalisées1. Sections de paraffine n’étaient pas utilisées ici afin d’éviter les difficultés liées à la phalloïdine coloration d’actine-F dans les sections de paraffine.

En raison de la conservation des séquences d’acides aminés adjacents à girdin tyrosine-1798, pY1798 anticorps peuvent être appliqués pour souiller TCs en espèces autres que les souris, y compris le rat et l’homme. Le remplissage de la gélatine utilisé dans le présent protocole peut aussi être appliqué aux autres organes creux. En effet, en dehors de la pY1798 ou TC, la combinaison de la gélatine avec recherche d’antigène de basse température de remplissage peut être utile pour révéler notoirement épitopes « difficile » dans l’intestin de souris et en conséquence, peut-être être d’intérêt pour beaucoup de chercheurs.

Le rôle biologique de girdin et l’importance de sa phosphorylation aux TC ne sont pas claires. Cependant, une étude réalisée par Lin et al. a suggéré que la tyrosine phosphorylation de girdin est associée avec le degré de polymérisation de l’actine-F8. Pendant ce temps, Kuga et coll. ont trouvé que lethal doses d’inducteurs d’apoptose (e.g., cisplatine, rayons x) provoqué une forte augmentation dans la fréquence relative des CT dans l’intestin des souris qu’ils ont émis l’hypothèse peut être associée à la aménager des entérocytes à TCs, en synchronisation avec la phosphorylation de girdin à microvillosités1. Cette possibilité exigera une investigation supplémentaire à l’avenir. Trois groupes ont récemment fait remarquer rapides augmentent fréquence TC après infection de parasite15,16,17. Ainsi, cette coloration flottant pourrait servir non seulement à analyser les tissus de l’intestin humain prélevés par voie endoscopique, mais accumulation TC pourrait également aider au diagnostic de l’infection de parasite dans l’intestin humain.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Naoya Asai à l’Université de Nagoya pour fournir des suggestions utiles pour le développement de la recherche d’antigène de la basse température pour les sections de jéjunum flottant. Ce travail a été soutenu par les subventions pour Scientific Research (KAKENHI) (C) en 2012 (JP25460493) et (B) en 2017 (JP17H04065) de la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS), A-étape accorde en 2014 (AS251Z02522Q) et en 2015 (AS262Z00715Q) de la Japan Science and Technology Agency (JST) et un visionnaire de Takeda Research Grant 2014 de la Fondation de la Science de Takeda (M.A.).

Materials

Slc:DDY 6-week-old female mice Chubu Kagaku Shizai Not applicable
Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) Wako 196-02835
Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O Wako 199-02825
Sodium chloride (NaCl) Wako 199-10665
Triton X-100,  Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether Katayama Chemical Not applicable
Sucrose Wako 190-00013
10% buffered neutral formalin solution Muto Chemical 20215 Step 1.3.
Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin ThermoFisher Scientific A12381
Methanol Nacalai Tesque 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306
N.N-dimethylformamide (DMF) Nacalai Tesque 13015-75
Bovine serum albumin Sigma A9647-10G
18-gauge stainless steel straight needle Terumo NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun Kono Seisakusho Not applicable
22-gauge winged needle Terumo SV-22DLK
20 mL TERUMO syringe Terumo SS-20ES
50 mL centrifuge tube TPP 91050
15 mL Iwaki centrifuge tubes Iwaki 2325-015
1.5 mL micro test tube Star RSV-MTT1.5
Gelatin powder, Gelare-blanc Nitta Biolab 2809
Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece Sakura FineTech 4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) Shoei Work's 1101-3
Isopentane Nacalai Tesque 26404-75
Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip Corning 353001
Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x Dako S2367 Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.
Protein Block Dako X0909 Blocking solution in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X 28143 Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11034
Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36930
Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 Matsunami Glass C022221
Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy Merck Millipore 107961
MAS-coated slide glass white Matsunami Glass MI-MAS-01
Wooden Mappe KO-type Shoei Work's 99-40007
Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml Zeiss 444960
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) Gilson F144801, F123600, F123601, F123602
Ultrapure water production system Advantec GS-590
Plastic glove, Star Nitrile Glove Star RSU-NGVM
Cryostat Leica Microsystems CM1950
Deep freezer, SANYO Ultra Low Sanyo MDF-382
Showcase refrigerator Nihon Freezer NC-ME50EC
Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) Taitec 0068750-000
Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) Taitec HB-100
Incubation chamber for immunostaining Cosmo Bio 10DO
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) Taitec NR-1
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) Tokyo Rika Kikai MMS-3010
Stereoscopic microscope (for tissue handling) Olympus SZ61
Stereoscopic microscope (for Figure 1B) Leica Microsystems M165FC
Fluorescence microscope (for Figure 3) Nikon E800
Confocal laser-scanning microscope Zeiss LSM700
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References

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Mizutani, Y., Kuga, D., Iida, M., Ushida, K., Takagi, T., Tokita, Y., Takahashi, M., Asai, M. Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections. J. Vis. Exp. (133), e57475, doi:10.3791/57475 (2018).
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