Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve gelişimsel araştırma, Aichi insan Servis Merkezi Enstitüsü kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (uygulama numarası: M-03). 1. hazırlıkları Fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 L hazırlamak: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, 4,5 g NaCl 80.0 g (RT) oda sıcaklığında 10 L. mağaza çözümün nihai bir birime ultrasaf su eklenir. PBS-T: 200 mL PBS adım 1.1 ile polyoxyethylene(10) octylphenyl eter 100 µL % 0.05 (vol:vol) son bir konsantrasyon için 200 mL hazırlayın. Mağazada RT. Eldiven ve göz koruması giyen, 50 mL % 15 Sükroz arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözümde hazırlamak: 7.5 g Sükroz % 10 eklendi, tarafsız formalin çözüm (Tablo reçetesi) 50 mL nihai bir birime arabelleğe alınmış. Mağazada RT.Dikkat: Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözüm içinde formaldehit teneffüs ve/veya deri/göz kişiyle tehlikeli olabilir. Dikkatli bir şekilde başa. 1.5 mL 200 adet/mL phalloidin-floresan boya eşlenik stok çözeltisi hazırlamak: phalloidin-floresan boya eşlenik (1 flakon, liyofilize katılar, uyarma ve emisyon dalga boylarında 300 kontur: 581 nm ve 609 nm, sırasıyla) 1,5 mL askıya metanol. Karanlıkta-20 ° C’de çözümde mağaza 5 mg / mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole hazırlamak, dihydrochloride (DAPI) stok çözüm: DAPI 10 mg 2 ml n, N-dimethylformamide (DMF). Karanlıkta-20 ° C’de çözümde mağaza %5 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde hazırlamak: 0.5 gram BSA, PBS 10 mL. 4 ° C’de mağaza Eğimli bir nipper kullanarak bir 18’lik düz iğne ucunu kaldırın ve sıvı iğne Lümen (şekil 1A1) akış izin vermek için bir boyuna yönde nipped sonuna bir pincher ile çimdik.Not: Protokol burada duraklatılmış. 2. hayvan diseksiyon ve yalıtım değişir Bir fare perfüzyon fiksasyonu Eldiven giymek ve iyi havalandırılan bir alanda iş. 100 mL cam kabı hazırlamak, % 10 arabelleğe tarafsız formalin çözüm, cerrahi araçlar (makas, pens), metalik bir tepsi, 6-0 naylon dikiş, 1.7 olduğu gibi hazırlanan bir 18’lik düz iğne kesmek bir 22’lik kanatlı iğne, 20 mL şırınga. 20 mL % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözeltisi cam kabı 20 mL şırınga yük ve 22’lik kanatlı iğne prizine takın. Sıvı jelatin PBS (son % 5 jelatin) 20 ml 50 mL santrifüj tüpü içinde 1 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. RT 15 dakikadır iliklerine kadar bir su banyosu için 15 dk 50 ° C’de kuluçkaya sallayarak olmadan. Kısaca girdap ve başka bir 15 dakika jelatin tamamen erimesi 50 ° C’de kuluçkaya. Tüp kadar kullanmak RT bırakın. Yetişkin bir fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Adım 2.1.6 fareden metalik bir tepsiye yerleştirin ve cerrahi araçlarını kullanarak ensiform kıkırdak ile cilt üzerinde küçük bir kesi yapmak. Kesik göğüs ve karın bölgelerinde ortaya çıkarmak için her iki el ile genişletin. Diyafram ortaya çıkarmak için karın zarını açın ve sonra her iki tarafta diyaframı açın. Her iki tarafta anterior aksiler çizgisinde göğüs kafesi kesilmiş, sonra kalp ortaya çıkarmak için timus konumunda enine yönde keserek torasik duvarın kaldırın. Kanı ve bir 22’lik kanatlı iğne sol ventrikül apex eklemek için sağ atrium auricle üzerinde küçük bir kesi yapmak. % 10 kurcalayarak sıvı için itme pistonu tarafsız formalin çözüm arabelleğe alınmış. Pelvis organlarda ortaya sonra rektum anüs üzerinden sonu kesti ve bağırsak bıçaklanmasından kesim tarafından vücuttan ayrı. Değişir yalıtmak için bağırsak mide test anal tarafındaki 4 cm kesti. Kalan ince bağırsak anal yarısı atın. Değişir reçeteye göre sarf yordamı kolaylaştırmak için ikiye küçük. Yük % 10 20 mL tarafsız formalin çözüm 20 mL şırınga arabelleğe alınmış ve çıkış 1.7. adımda hazırlanan 18’lik düz iğne ekleyebilirsiniz. Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin eriyik–dan bir son-in kirpik değişir bağırsak içeriğini floş için ve gut Lümen yüzey (şekil 1A2) düzeltmek için enjekte. Gut Lümen 2.1.15 adımda anlatıldığı gibi PBS enjekte edilerek yıkayın. PBS ile sıvı jelatin yerine 2.1.15 adımda açıklandığı gibi bağırsak Lümen içine sıvı jelatin floş. 6-0 naylon kullanarak dikiş ligasyonu tarafından kısaltıldı değişir yakın bir ucunu dikiş kesip, değişir sıvı jelatin ile doldurun ve ucunu dikiş ligasyonu (şekil 1A3) kapatın. Depresif bölümüne bir cryomold (şekil 1A4) bir sosis şeklinde değişir bölümü sığacak şekilde dört dikiş knot ekleyin.Not: bir 20 x 25 mm x 5 mm depresif bölümü ile cryomolds için bir ~ 20 mm sosis gibi değişir bölümü tercih edilir. 50 ml % 15 Sükroz gecede 4 ° C’de % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözümde dokular emmekNot: Aşağıdaki adımları cryoprotection tarafından jelatin ve doku formalin sukroz ve protein fiksasyon tarafından emin olun. Oysa RT. sabit olmayan gelatinized jelatin 4 ° C’de erir formalin gelatinized jelatin RT eritmek değil 3. donma jelatin dolu değişir dokuların oturtun Dikiş saatte mil hızla değişir kesim tarafından üç sosis gibi değişir taşlarla bakmaksızın her iki ucu (şekil 1A4) elde edilir. Sosis gibi parçalar halinde dondurulmuş doku numunelerin hazırlanması için bileşik katıştırma ek bir cryomold hizalayın. Ek nitrojen ile soğutmalı isopentane cryomold dondur. Cryomolds-80 ° C’de depolayınNot: Protokol burada duraklatılmış. 4. tutam ayirt serbest yüzer Cryosections kullanarak hücreleri Cryosectioning Cryostat Oda sıcaklığı (CT) ve nesne sıcaklık (OT)-22 ° c için ayarla Yer donmuş doku engellemek için en az 15 dakika cryostat odasında bir cryomold içinde. PBS 3 mL 35-mm kültür yemek için ekleyin. Donmuş doku blok cryomold kaldır ve blok değişir enine bölümünü ortaya çıkarmak için bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Bir mount kesme düzleminin jilet ile bölüm için bir ayna (cryostat adaptör) blokta yarısı. Bölüm 30 µm kalınlığında bölümlere jelatin dolu değişir. Forseps yavaşça 4.1.2 (şekil 2Bdeğil) adımda hazırlanan 35-mm kültür çanak içine bölümleri aktarmak için dondurulmuş kullanın. Birincil antikorlar uygulanması 3 hafif sallayarak üzerinde karşılıklı bir shaker ile mL PBS-T ile her 5 min için 3 kez 35-mm kültür çanak serbest yüzer bölümlerde yıkayın (yaklaşık 36 kez / dk). Hazırlayın Antigen alma çözüm: 0.3 mL 2.7 ml ultrasaf su antijen alma çözüm konsantresi (Malzemeler tablo). Antijen alma çözüm 3 mL serbest yüzer bölüm içeren 35-mm kültür yemek için ekleyin. Kapağını kapatın, çanak ve kapak vinil bandın bir şerit ile arasındaki boşluğu mühür ve 50 ° c 3 h için hibridizasyon kuluçka kuluçkaya sallayarak olmadan. Çanak kuluçka ve serin RT, 20 dk kaldırın. Vinil teyp kaldırdıktan sonra 3 kez 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın. PBS-T Aspire edin ve engelleme çözüm (Tablo reçetesi) bölümleri üzerine 5 damla ekleyin. RT hafif sallayarak ile 5 min için kuluçkaya. Birincil antikor çözüm hazırlamak: PBS %5 BSA 495 µL 5 µL fosfo-Y1798 (pY1798) girdin antikor (Malzemeler tablo) ile. Birincil antikor çözüm (engelleme çözüm kaldırılması gerekmez) bölümler üzerine 500 µL ekleyin. Bir oksijen kuluçka odasında çanak yerleştirin ve gecede 4 ° c hafif sallayarak ile kuluçkaya.Not: Gece kuluçka ilâ üç gece için genişletilebilir. İkincil antikorlar uygulanması 3 kere 5 min için her 3 ml hafif sallayarak ile PBS-t bölümleri yıkayın. Seyreltilmiş DAPI hisse senedi çözüm hazırlamak: 2 µL DAPI hisse senedi çözüm (Adım 1.5), PBS 998 µL. İkincil antikor çözüm olun: 476 µL PBS, seyreltilmiş DAPI çözüm, phalloidin-floresan boya eşlenik hisse senedi çözüm 12.5 µL, keçi Anti-tavşan IgG-floresan boya eşlenik 1 µL 10.5 µL % 5 BSA (dalga boyu: uyarma 496 nm, emisyon 520 nm). PBS-T aspirating sonra ikincil antikor çözümü uygulamak ve hafif sallayarak ile 30 dk için RT, bir ışık korumalı kuluçka odasında kuluçkaya. 3 kere 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın. Son yıkama sonra PBS-T kaldırın ve polyoxyethylene(10) octylphenyl eter eksik PBS 3 mL ile değiştirin. Yemek için stereoskopik mikroskop aktarın. Bir damlacık bir MAS kaplı beyaz cam slayt ve transfer bir değişir bölümünden P200 damlalıklı ucu kullanarak damlacık amacına ortasına içinde yer 200 µL PBS. Bölüm hizalama stereoskopik mikroskop altında ayarladıktan sonra bölümü çevreleyen tüm kalan PBS Aspire edin. 20 µL sulu montaj medya ekleyin ve 20 x 20 mm coverslip medya üstüne yerleştirin. Hemen coverslip kenarları montaj Ksilen tabanlı medya ile kapatın. Slayt üzerinde bir ahşap mappe yerleştirin ve RT 2-3 h için kuvvetlendirmek montaj Ksilen tabanlı medya sağlar.Not: Protokol burada duraklatılmış. Sonra montaj Ksilen tabanlı medya katılaşır, slaytları 2-3 hafta boyunca RT. adlı bir ışık korumalı slayt kutusunda saklanabilir 5. confocal mikroskobu Daldırma yağ confocal mikroskop 63 X amaçta koyun. Coverslip-slayt geri çevirmek ve slayt sahne alanı üzerine yerleştirin. Lazer dalga boyu 405, 488 ve 555 nm’de alınan TC görüntüleri dijital ortama ve görüntüleri TIFF biçimi (.tiff) kaydedin.Not: floresan boyalar için uygun olan bir algılama filtre seçin (yani, uyarma/emisyon maxima: 358/461 nm, 490/525 ve 590/617).