Summary

Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в пределах грызунов прилежащем инновационные РНК в месте обнаружения технологии

Published: March 27, 2018
doi:

Summary

Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в прилежащем имеет решающее значение для прояснения дисфункции рецептор D1 во время болезни центральной нервной системы. Мы исполняли Роман РНК в situ гибридизация пробирного визуализировать одной молекулы РНК в области конкретных мозга.

Abstract

В центральной нервной системе подтип рецепторов D1-альфа (Drd1α) является наиболее распространенных рецептора допамина (DA), которая играет жизненно важную роль в регулировании нейрональных роста и развития. Однако лежащих в основе Drd1α рецептор аномалии посреднической поведенческих реакций и модулирует функции памяти рабочих механизмов по-прежнему неясны. С помощью Роман РНК в situ гибридизация пробирного, текущего исследования определили допамина Drd1α рецептор и тирозина гидроксилазы (TH) РНК выражение от связанных с DA цепь в nucleus accumbens (NAc) области и региона substantia nigra (SNR), соответственно. Drd1α выражение в Североатлантическом совете показывает «дискретные точка» окрашивание шаблон. Четкие половые различия в Drd1α выражении наблюдались. В противоположность этому й показывает шаблон «кластерной» окрашивание. Что касается й выражение самок крыс отображается выражение выше сигнала на ячейку относительно Мыжские животные. Представленные здесь методы предоставляют Роман в situ гибридизация техника для изучения изменений в дисфункции системы допамина при прогрессировании заболевания центральной нервной системы.

Introduction

Дисфункция системы допамина полосатой участвует в прогрессии клинические симптомы, наблюдаемые в нескольких нейрокогнитивный заболеваний. Приемные устройства допамина D1 присутствуют в префронтальной коре (ПФУ) и полосатой регионах мозга и сильно влияние когнитивные процессы1, включая рабочей памяти, временной обработки и тепловоз поведение2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. предыдущие исследования раскрыты, что изменения приемные устройства допамина D1 были связаны с прогрессированием внимания гиперактивности дефицита расстройства (СДВГ)8, нейрокогнитивный Симптомы шизофрении9, 10 и стресс восприимчивость11. Конкретно в шизофрении, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) исследования показали, что способность привязки D1 рецепторы допамина в префронтальной коре высоко была связана с познавательных дефицитов и наличие негативных симптомов11. Дендритных рост возбуждающих нейронов в префронтальной коре, регулируется рецептора допамина D1 снимает стресс восприимчивости. Кроме того сногсшибательно рецептор D1 в медиальной префронтальной коры головного мозга (mPFC) нейронов может повысить социальный поражения стресс индуцированного социальной избежания12.

Здесь мы представляем Роман технику РНК в situ гибридизация визуализировать одной молекулы РНК в клетке с образцами тканей свежемороженые. Настоящий метод имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, которые существуют в рамках текущей литературы. Во-первых нынешняя процедура сохраняет контекст пространственных и морфологических ткани и была исполнена на образцы тканей свежемороженые так, что другие процедуры, требующие свежие, невстроенный тканей могут быть объединены с текущими методами. Аналогичные процедуры в формалин исправлена и парафин врезанных тканей показали, что один транскрипции урегулирование может быть достигнуто с помощью РНК в situ гибридизация техника13. Обнаружение на уровне одного транскрипции РНК предоставляет улучшенные чувствительность к низкой копии номер выражения, а также возможность сравнить экспрессии генов на уровне отдельных ячеек, которые не могут быть достигнуты другими методами обнаружения нуклеиновой кислоты, такие методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того текущий метод поддерживает изображения с высоким соотношением сигнал шум через весьма специфические РНК зонды которые гибридизированных к одной цели РНК стенограммы и последовательно связаны с Каскад молекул усилители сигнала для обнаружения системы. Наконец настоящий технология обеспечивает возможность оценить несколько биологических систем с ее целевой объект специфического несвободных зондов, а не ограничивая наши расследования только один класс маркеров, связанных с системой, например обнаружение белка методы иммуногистохимии.

В нашем исследовании мы использовали этот роман РНК в situ гибридизация для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в Substantia (SNR) F344/N крыс обоего пола. Инновационный РНК в situ гибридизация позволило нам изучить механизмы, влияющие на поглощение да и да релиз одновременно, улучшение нашего понимания сложности системы полосатой да. Здесь, мы описать процедуру свежемороженые мозга ломтиками и предоставляют методы анализа данных для различных шаблонов окрашивание: «дискретные точка» или «группы».

Protocol

Экспериментальный протокол был одобрен животное уход и использование Комитет (IACUC) в университете Южной Каролины (федеральные гарантии номер: A3049-01). 1. Подготовка секций свежий замороженные мозга Используйте F344/N штамм крыса: три крыс каждого пола, 13 месяцев, вес прим?…

Representative Results

Настоящее исследование наблюдается «дискретных точек» окрашивание шаблон для выражения РНК в дофаминовых рецепторов D1-альфа (Drd1α) САС в F344/N крыс (рис. 1A). Флуоресценции отдельных сигналов были легко идентифицированы и может рассматриваться как единый …

Discussion

В этом протоколе мы описываем Роман технику в situ гибридизация свежемороженые мозга фрагментов для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в регионе nigra substantia (SNR). Мы также предоставляем методы анализа данных для различных шаблон?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Настоящей работы были поддержаны национальные институты здравоохранения (NIH) грантов, HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624. Частичные фонд оказали NIH T32 обучения Грант в биомедицинских и поведенческих наук.

Materials

HybEZ Oven system Advanced Cell Diagnostics  310010
RNAscope Probe – Rn-Drd1a Advanced Cell Diagnostics  317031 Color channel 1, Green
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 Advanced Cell Diagnostics  314651-C2 Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics  320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154% 
4% paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack Fisher Scientific NC9837976
Tissue-Tek staining dish Fisher Scientific NC0731403
Precision General Purpose Baths ThermoFisher Scientific TSGP28
Pretreatment 4 Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent Life Technologies P36930
Amp 1-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 2-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 3-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 4-FL-Alt A Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
EZ-C1 software package Nikon Instruments version 3.81b
SAS/STAT Software SAS Institute, Inc., version 9.4

References

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. 신경과학. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. 신경과학. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
check_url/kr/57444?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Li, H., Illenberger, J. M., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology. J. Vis. Exp. (133), e57444, doi:10.3791/57444 (2018).

View Video