Digitalização de slides automatizado e segmentação em tecidos fluorescente-rotulado, usando um sistema de análise de Widefield alto teor
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para a segmentação automática de tecidos fluorescente etiquetadas em slides utilizando um sistema de análise de alto teor widefield (WHCAS). Este protocolo tem aplicações abrangentes em qualquer campo que envolve a quantificação de marcadores fluorescentes em tecidos biológicos, incluindo as ciências biológicas, engenharia médica e Ciências da saúde.
Abstract
Automatizado de digitalização de slides e segmentação dos tecidos fluorescente-etiquetadas é a maneira mais eficiente de analisar toda slides ou grandes cortes histologicos. Infelizmente, muitos investigadores gastam grandes quantidades de tempo e recursos, desenvolvimento e otimização de fluxos de trabalho que só são relevantes para suas próprias experiências. Neste artigo, descrevemos um protocolo que pode ser usado por aqueles com acesso a um sistema de análise de alto teor widefield (WHCAS) para a imagem de qualquer tecido de slide-montado, com opções de personalização em módulos pré-construídos encontrados no software associado. Não originalmente destinados à digitalização de slides, os passos detalhados neste artigo possibilitam adquirir slide Digitalizando imagens na WHCAS que podem ser importados para o software associado. Neste exemplo, a segmentação automática de slides do tumor de cérebro é demonstrada, mas a segmentação automática de qualquer marcador fluorescente-etiquetadas nuclear ou citoplasmática é possível. Além disso, há uma variedade de outros módulos de software quantitativa, incluindo ensaios para a localização da proteína/translocação, proliferação celular/viabilidade/apoptose e angiogênese que pode ser executados. Esta técnica vai poupar esforço e tempo de pesquisadores e criar um protocolo automatizado para análise de slide.
Introduction
A quantificação exata e precisa dos tecidos fluorescente-etiquetadas em slides é uma técnica altamente procurada em muitos campos científicos. No entanto, pesquisadores muitas vezes manualmente contam espécimes ou gastam uma quantidade considerável de tempo desenvolvendo esotéricas técnicas automatizadas para conseguir isso. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para o slide automatizado digitalização e quantificação de células usando uma WHCAS e seu software associado, com células do sistema imunológico inatas nas seções de tumor de cérebro humano congelado como exemplo. Os softwares associados oferece uma ampla gama de built-in módulos personalizáveis do axônio consequência contando para diferenciação de célula tipos1,2,3,4,5, 6. o objetivo desse método é proporcionar a investigadores com um protocolo de início ao fim, facilmente reproduzível para adquirir imagens de e dosar entidades fluorescente-etiquetadas em quaisquer tecidos slide-montado.
Neste protocolo, o WHCAS é usado principalmente para placas de imagem de para a posterior análise do software associado mesmo que um adaptador de slide e o básico para deslizar a digitalização7 estava disponível. Era proibitivo para slides imagem porque a cuidado calibração espacial da área de aquisição, a seleção de periódicos apropriados, a criação de loadouts adaptados e uma ligação com os representantes do produto foram necessárias. No mais vasto corpo de literatura, em vez de comprar uma imagem de slide dedicada e análise aparelhos8, um relatório anterior tecnológico com acesso a este software contornado a aquisição de imagens de slides no WHCAS no total9. Realização de análise de imagem ou de aquisição de imagem em plataformas diferentes requer trabalho extra para garantir que cada um é compatível com o outro.
A capacidade de usar o WHCAS e seu software para captura de imagem gostaria de evitar as complicações desnecessárias de procura ou desenvolver um alien de fluxo de trabalho para essas ferramentas. Neste artigo, os passos necessários para criar uma varredura de visão baixa ampliação e as correspondentes imagens de alta ampliação, tratando o slide como um prato, e as análises subsequentes usando o módulo de segmentação de comprimento de onda multi célula marcando que permitem a redefinição de objetivos do WHCAS. Este protocolo prontamente utilizável fornece uma vantagem sobre técnicas alternativas porque não há nenhuma necessidade de desenvolver algoritmos ou várias etapas contando protocolos10,11 , uma vez que as imagens são adquiridas no WHCAS. Este protocolo reduz o tempo necessário para otimizar uma técnica de quantificação, é mais preciso12 e eficiente que a contagem manual e maximiza o uso da WHCAS. Este protocolo pode ser fácil e amplamente usado desde que permite que a imagem e a análise de quaisquer tecidos fluorescente-etiquetadas em slides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um comum problema impedindo a eficiência da pesquisa em ciências biológicas é o desenvolvimento de protocolos para a quantificação de imparcial, exata e precisa dos tecidos fluorescente-etiquetadas e suas estruturas dentro. Uma quantidade significativa de tempo e esforço é dirigida no sentido de encontrar maneiras de analisar lâminas de tecido, uma vez que eles têm sido fotografados. Muitos métodos existentes fornecem algoritmos para que os usuários recriar dentro de programas12,13,14. Esses métodos são aceitáveis, mas a importância deste relatório é que ele permite que o usuário facilmente e rapidamente estabelecer uma aquisição de imagem holística e protocolo de análise, se o usuário tem acesso a um WHCAS. Ensaios que diferenciam os tipos de células e quantificar várias estruturas e processos, análise de ciclo celular e translocação nuclear, por exemplo, já estão disponíveis no software associado.
A configuração envolve alguns passos críticos. Em primeiro lugar, os parâmetros espaciais do slide são definidos como se fosse um prato. Em segundo lugar, um exame de visão baixa ampliação é criado de que regiões de interesse são selecionadas para a imagem latente de alta ampliação. Por último, sites que afetam a precisão e a precisão das análises subsequentes são excluídos. A maior limitação dessa técnica é que sua aplicabilidade depende se o usuário tem acesso a um WHCAS. No entanto, com a crescente necessidade de sistemas de análise de alto teor, muitas instituições estão fornecendo estas para seus pesquisadores para permanecer competitiva15. Solução de problemas é necessário mais comumente quando cortes histologicos não têm a mesma espessura. Se várias regiões de interesse são selecionadas, alguns estarão em foco, enquanto os outros não vão. Idealmente, durante o corte, o usuário cuidaria para criar amostras homogêneas. No entanto, se as amostras são inconsistentes, o foco sobre o comprimento de onda nuclear mancha (ou fluoróforo mais brilhante do usuário), que é usada para foco, pode ser reajustado para cada região fora do foco de interesse e até mesmo para cada campo de visão. Como os outros comprimentos de onda são simplesmente offset do comprimento de onda de mancha nuclear, apenas neste comprimento de onda precisa de reajuste.
Neste relatório, detalhamos como digitalizar e analisar slides usando um WHCAS e software associado. O módulo de comprimento de onda multi célula marcando permite ao usuário contar automaticamente qualquer marcadores nucleares ou citoplasmáticos que são rotulados fluorescente. Após ajustar as configurações de foco e definição das características celulares, tais como largura e área para personalizar o módulo no tecido cuja imagem, não há necessidade de intervenção do usuário obter a imagem de slides e dados quantitativos. Até três slides pode ser fotografada em um momento e várias regiões de interesse podem ser definidas. Esta função permite protocolo WHCAS os usuários que precisam analisar slides aproveitar personalizável, multiuso, automatizado de fluxos de trabalho que não exigem pouca ou nenhuma otimização e podem ser aplicados em todos os projetos no futuro que envolvem a análise histológica do tecido.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado por uma concessão do institutos canadenses de pesquisa em saúde e Alberta inova – saúde soluções/Alberta Cancer Foundation. Os autores desejam reconhecer a unidade de regeneração na instalação de núcleo de neurobiologia para o uso de seus equipamentos, o trabalho de Paula Gedraitis na construção da Fundação sobre a qual foi viabilizada slides digitalização sobre o WHCAS e o criador dos produtos mencionados neste artigo, dispositivos moleculares.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
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