مسح الشرائح الآلي وتجزئة في الأنسجة المسمى فلوريسسينتلي باستخدام نظام تحليل ويديفيلد عالية-المحتوى
Summary
هنا يصف لنا بروتوكول لتجزئة الآلي للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح باستخدام نظام تحليل محتوى عالية ويديفيلد (وكاس). هذا البروتوكول له تطبيقات واسعة النطاق في أي حقل الذي ينطوي كوانتيتيشن علامات مضيئة في الأنسجة البيولوجية، بما في ذلك العلوم البيولوجية والهندسة الطبية، والعلوم الصحية.
Abstract
الشريحة المسح الآلي وتجزئة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي هو الطريقة الأكثر فعالية لتحليل الشرائح كاملة أو أجزاء كبيرة من الأنسجة. لسوء الحظ، العديد من الباحثين أنفاق مبالغ كبيرة من الوقت والموارد في تطوير وتحسين سير العمل ذات الصلة بالتجارب الخاصة بهم فقط. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول التي يمكن أن يستخدمها أولئك مع إمكانية الوصول إلى نظام تحليل محتوى عالية ويديفيلد (وكاس) للصورة أي أنسجة مثبتة على الشريحة، مع خيارات للتخصيص ضمن وحدات بنيت قبل العثور على البرمجيات المرتبطة بها. المقصود ليس أصلاً لمسح الشرائح، بالخطوات المفصلة في هذه المادة تجعل من الممكن الحصول على الشريحة مسح الصور في وكاس التي يمكن استيرادها إلى البرنامج المقترن. في هذا المثال، يتجلى الآلي تقسيم الشرائح ورم الدماغ، لكن من الممكن تجزئة الآلي لأي علامة النووية أو هيولى المسمى فلوريسسينتلي. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة متنوعة من وحدات كمية البرامج الأخرى بما في ذلك فحوصات للبروتين التعريب/إزفاء، انتشار الهاتف الخلوي/السلامة/المبرمج والأوعية التي يمكن تشغيلها. هذا الأسلوب سيتم حفظ الباحثين من الوقت والجهد وإنشاء بروتوكولا الآلي لتحليل الشريحة.
Introduction
كوانتيتيشن صحيحة ودقيقة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح تقنية عالية رواجا في كثير من الميادين العلمية. غير أن الباحثين غالباً ما يدوياً عد عينات أو تنفق قدرا كبيرا من الوقت تطوير تقنيات الآلي مقصور على فئة معينة لتحقيق هذا الهدف. هنا، نحن نقدم بروتوكولا للشريحة الآلي المسح الضوئي وكوانتيتيشن من الخلايا باستخدام وكاس والبرمجيات المرتبطة بها، مع الخلايا المناعية الفطرية في أقسام ورم الدماغ البشري المجمدة كمثال. البرمجيات المرتبطة بها تشكيلة واسعة من المدمج في وحدات قابلة للتخصيص من ثمرة نيوريتي عد إلى التفريق بين الخلية أنواع1،2،3،،من45، 6-والهدف من هذا الأسلوب تزويد الباحثين ببروتوكول بدء-إلى-انتهاء، واستنساخه بسهولة للحصول على صور وكوانتيتاتي الكيانات المسماة فلوريسسينتلي في أي أنسجة مثبتة على الشريحة.
في هذا البروتوكول، وكاس يستخدم أساسا لتصوير لوحات للتحليل اللاحق على البرمجيات المرتبطة بها على الرغم من أن محول شريحة والاساسيات الشريحة المسح7 متاحة. كان مانعة لشرائح الصورة نظراً لأن هناك حاجة إلى معايرة المكاني الدقيق في مجال اقتناء واختيار المجلات المناسبة وإنشاء loadouts مصممة واتصال مع ممثلي المنتج. في الجسم أوسع من الأدب، بدلاً من شراء تصوير شريحة مخصصة و جهاز تحليل8، التحايل تقرير تكنولوجية سابقة مع إمكانية الوصول إلى هذا البرنامج الحصول على الصور من الشرائح في الإجمال وكاس9. إجراء تحليل اقتناء أو صورة صورة على منصات مختلفة تتطلب العمل الإضافي لضمان كل متوافق مع الآخر.
القدرة على استخدام وكاس والبرامج الخاصة به لالتقاط الصور من شأنه تجنب التعقيدات غير الضرورية للبحث عن أو النامية غريبة سير عمل بهذه الأدوات. في هذه المقالة، الخطوات المطلوبة لإنشاء تفحص نظرة عامة على تضخم منخفض والصور عالية التكبير المقابلة بعلاج الشريحة كلوحة، والتحاليل اللاحقة استخدام الوحدة النمطية لتجزئة “سجل خلية” متعددة الطول الموجي تسمح repurposing وكاس. يوفر هذا البروتوكول جاهزة للاستعمال ميزة على تقنيات بديلة لأنه ليس هناك حاجة لتطوير خوارزميات أو بروتوكولات متعددة خطوة العد10،11 مرة تكتسب الصور على وكاس. هذا البروتوكول تقليل الوقت المطلوب لتحسين أسلوب كوانتيتيشن، وهو أكثر دقة12 وكفاءة من العد اليدوي وتعظيم استخدام وكاس. هذا البروتوكول على نطاق واسع وسهولة استخدامها نظراً لأنه تمكن من تصوير وتحليل أي أنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح.
Protocol
Representative Results
Discussion
ما زالت مشكلة مشتركة التي تعوق كفاءة بحوث العلوم البيولوجية هو وضع بروتوكولات للتحديد الكمي غير متحيزة ودقيقة، ودقيقة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي وهياكلها داخل. كميات كبيرة من الوقت والجهد تتجه نحو إيجاد طرق لتحليل شرائح الأنسجة بمجرد أنهم قد تم تصويرها. توفر العديد من الأساليب القائمة خوارزميات للمستخدمين لإعادة داخل البرامج12،،من1314. هذه الأساليب مقبولة، ولكن أهمية هذا التقرير أنه يمكن للمستخدم بسهولة وبسرعة إنشاء الحصول على صورة شاملة وتحليل البروتوكول إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى وكاس. فحوصات أن التفريق بين أنواع الخلايا وقياس عدة هياكل وعمليات وتحليل دورة الخلية والنووية إزفاء، على سبيل المثال، متاحة بالفعل في البرنامج المقترن.
ويشمل برنامج الإعداد بضع خطوات حاسمة. أولاً، يتم تعريف المعلمات المكانية للشريحة كما لو كانت لوحة. ثانيا، يتم إنشاء تفحص نظرة عامة على تكبير منخفض الذي يتم تحديد المناطق ذات الاهتمام لتصوير التكبير عالية. وأخيراً، يتم استبعاد المواقع التي تؤثر على دقة ودقة التحاليل اللاحقة. الحد الأكبر من هذا الأسلوب أن تطبيقه يعتمد على إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى وكاس. ومع ذلك، مع تزايد الحاجة إلى نظم تحليل المحتوى السامي، يقدمون العديد من المؤسسات هذه للباحثين على أن تظل قادرة على المنافسة15. استكشاف الأخطاء وإصلاحها هو الحاجة الأكثر شيوعاً عند أبواب الأنسجة لا تملك نفس سمك. إذا لم يتم تحديد مناطق متعددة من الفائدة، سيكون بعض في التركيز، بينما الآخرين لن. ومن الناحية المثالية، أن العناية خلال تمزيقها، المستخدم لإنشاء عينات متجانسة. ومع ذلك، إذا كانت العينات غير متناسقة، يمكن تعديل التركيز على الطول الموجي وصمة عار النووية (أو ألمع fluorophore المستخدم)، الذي يستخدم للتركيز، لكل منطقة خارج نطاق التركيز للاهتمام، وحتى بالنسبة لكل حقل من عرض. ويقابل الأطوال الموجية الأخرى ببساطة من الطول الموجي النووية وصمة عار، فقط هذا الطول الموجي تحتاج التعديل.
في هذا التقرير، نحن بالتفصيل كيفية مسح وتحليل الشرائح باستخدام وكاس والبرامج المرتبطة بها. الوحدة النمطية “سجل خلية” متعددة الطول الموجي يسمح للمستخدم بالعد تلقائياً أي من علامات النووية أو هيولى المسماة فلوريسسينتلي. بعد ضبط إعدادات التركيز وتحديد الخصائص الخلوية مثل العرض والمجال لتخصيص وحدة للأنسجة المصورة، هناك أي حاجة لتدخل المستخدم للحصول على الشرائح المصورة والبيانات الكمية. يمكن تصويرها ما يصل إلى ثلاث شرائح في وقت واحد، ويمكن تعريفها بمناطق متعددة من الفائدة. يتيح هذا البروتوكول وكاس المستخدمين الذين هم بحاجة إلى تحليل الشرائح الاستفادة من التخصيص، متعددة الأغراض، الآلي مهام سير العمل التي تتطلب القليل إلى أي التحسين ويمكن تطبيقها في أي مشاريع في المستقبل التي تنطوي على التحليل النسيجي للأنسجة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا المشروع ممول بمنحه من المعاهد الكندية للبحوث الصحية ويبتكر ألبرتا-صحة الحلول/ألبرتا مؤسسة مكافحة السرطان. الكتاب يود الاعتراف “وحدة التجدد” في بيولوجيا الأعصاب الأساسية مرفق لاستخدام معداتهم، عمل جيدريتيس بولا في بناء الأساس الذي تسنى الشريحة المسح على وكاس، والخالق من المنتجات المشار إليها في هذه المادة، “الأجهزة الجزيئية”.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
