תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.
Abstract
כרומוזומים חייב להיות אמין, בצורה אחידה הפרדה לתאי הבת במהלך חלוקת התא mitotic. נאמנות של סגרגציה כרומוזומלית נשלטת על ידי מנגנונים מרובים הכוללים את מחסום הרכבה פלך (שק). הקרום הוא חלק מערכת משוב מורכבים כי הוא אחראי למניעת התקדמות התא באמצעות מיטוזה אלא אם כל kinetochores כרומוזומלית יש מחובר ציר microtubules. לקרטע כרומוזומלית, כרומוזום נורמלית סגרגציה הוא מחוון של מחזור התא לקוי שליטה מחסומים והוא יכול לשמש כדי למדוד את יציבות גנומית של חלוקת תאים. הסרת הפיקוח של הקרום יכול לגרום הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתא ממאיר דרך ההצטברות של שגיאות במהלך ההפרדה כרומוזומלית. יישום של השק ואת היווצרות קינטוכור מורכבים מוסדרים בחוזקה על ידי אינטראקציות בין kinases פוספטאז כגון 2A חלבון פוספטאז (PP2A). פרוטוקול זה מתאר תא חי הדמיה של משתרך כרומוזומים בתוך העכבר מתחלקים fibroblasts מבודד מן העכברים היה נוקאאוט של יחידת משנה התקינה PP2A-B56γ. שיטה זו גוברת על החסרונות של מחזור התא שליטה הדימות האחרות כגון cytometry זרימה או immunocytochemistry רק לספק תמונת מצב ציטוקינזה תא, במקום פריט חזותי ייתכן דינמי של כרומוזומים במהלך מיטוזה.
Introduction
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטה נוחה להמחיש סגרגציה כרומוזומלית והתקדמות mitotic במהלך מחזור התא בהעכבר מתחלקים fibroblasts באמצעות היסטון 2B-GFP, BacMam 2.0 תיוג והדמיה תא חי.
מחזור התא שליטה מחסומים לפקח על כרומוזום סגרגציה, יש תפקיד חשוב בשמירה על שלמות גנטי של התא 1,2,3. הצטברות של כרומוזומים אי הפרדה יכול להוביל aneuploidy, אשר מהווה סימן היכר של גידולים מוצקים ביותר 4. לפיכך, זיהוי מפגרות כרומוזומים יכול לשמש כשיטה ללמוד יציבות כרומוזומלית.
Fluorescently שכותרתו חלבונים יכולים להיות בשימוש לדמיין חיים כרומוזום סגרגציה, כרומוזומלית מפגרות אבל הדור של מתויג mCherry או חלבון ויזת עבודה H2B-GFP מתויג דורש ידע משמעותי של ג’ין משלוח וביולוגיה מולקולרית 5. כאן נתאר את השימוש ריאגנט CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, להלן בשם ריג’נט CL-HB, למען הפשטות. ריאגנט הזה יכול לשמש מיד ומסלקת ובכך חששות לגבי וקטורית באיכות ויושרה. בנוסף, ריאגנט הזה אינו דורש את השימוש טיפולים מזיקים או שומנים וכימיקלים העמסה לצבוע. שלא כמו תוויות פלורסנט קונבנציונלי, ההנהלה CL-HB כתמים ללא תלות פונקציה (כלומר., קרומית אפשרית). ההנהלה CL-HB יכול להיות פשוט להוסיף את התאים, מודגרות ללילה עבור ביטוי חלבון. ההנהלה CL-HB לא לשכפל תאים בתרבית של, ניתן להשתמש בהגדרות מעבדה 1 (BSL) אבטחה ברמה. בנוסף, ניתן להבחין תקנים ארעי זה לאחר לילה דגירה עד 5 ימים, מספיק זמן כדי לבצע ניתוחים הסלולר הדינמיים ביותר.
לחלופין, העיוותים כרומוזומלית יכול להילמד על ידי טכניקות שונות כגון cytometry זרימה, אימונוהיסטוכימיה או קרינה פלואורסצנטית באתרו הכלאה (דגים) 6. Cytometry זרימה ניתן ללמוד aneuploidy, אשר ניתן למדוד בהתבסס על תוכן ה-DNA, השלב של תאים במחזור התא. למרות cytometry זרימה יכול לשמש כדי למדוד aneuploidy, אינה מספקת מידע על סגרגציה שגויה כרומוזומלית. דגים וטכניקות אימונוהיסטוכימיה להשתמש הגששים פלורסנט כדי לאגד דנ א או כרומוזומים. ואילו טכניקות אלה מספקים תמונת המצב של אוכלוסיה של התאים, הם אינם מאפשרים תא חי הדמיה ובכך חסר מידע שהושג דרך ייתכן החזיית ציטוקינזה תאים מסוימים אחריו על פני תקופה של זמן.
פרוטוקול זה שימש ללמוד לקרטע כרומוזומים או סגרגציה שגויה כרומוזומלית ב nocodazole התייחסו העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מבודד PP2A-B56γ-עכברים. בתוספת מעל היישום, פרוטוקול זה מספק כלי פשוט כדי לתייג והמחש כרומוזומלית הפרדה בין סוגי תאים שונים אשר יכול לשמש כדי ללמוד מחזור התא תקנה או בחוסר יציבות כרומוזומלית תאים סרטניים. בנוסף, זה יכול לשמש גם ללמוד יציבות כרומוזומלית נגרמת על ידי טיפולים תרופות שונות, או לחקור את ההשפעות של ג’ין מדהימה וכתוצאה מכך כרומוזומלית סגרגציה שגויה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחזור התא שליטה מחסומים להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק למנוע אנאפלואידיה ותא טרנספורמציה 1,2,3. במחקר הנוכחי, מצאנו את איון של PP2A-B56γ, גרמו מחסום הרכבה פלך נחלש. הדמיה חיה תא אפשר לנו להתבונן כרומוזומלית סגרגציה שגויה במהלך מיטוזה ב PP2A-B56γ ME…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Hung גואו-Chiuan ד ר ד ר Bharatkumar ג’ושי להערות יקר זה לשפר את כתב היד.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
