Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Die Bildung von 3′-Ende ist ein entscheidender Schritt in mRNA-Reifung, die besteht aus der Spaltung der Pre-mRNA flussabwärts ein Pas, gefolgt von dem Zusatz von ~ 250 Untemplated Adenines, die Poly Tail^1,2ausmachen. Poly-Bindeprotein (PABP) bindet an das Poly-Heck, und das schützt die mRNA-Transkript vor Abbau und erleichtert die Übersetzung¹.

Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass 70 % der menschlichen Gene mehrere PASs haben und somit alternative Polyadenylation, wodurch mehrere 3′ Enden³zu unterziehen. So ist es wichtig zu erkennen, wo die Poly-Rute für den Rest der 3′ UTR legt, sowie identifizieren die PAS von jeder gegebenen Protokoll verwendet. Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation führte die gleichzeitige Identifikation von 3′ wo und den PASs von tausend Genen. Dieser Anstieg der Sequenzierung Fähigkeit erforderte die Entwicklung von der bioinformatische Algorithmen für die Datenanalyse mit alternative Polyadenylation vom 3′-Ende. Für die de-Novo -Erkennung oder Validierung des PAS und damit des 3′ Endes einzelner Gene von großflächigen Sequenzierungsdaten mapping bleibt 3′ Rennen die Methode der Wahl^4,5. Die Sequenzen in cDNA-Produkte von 3′ Rennen enthalten normalerweise enthalten nur einen Teil der 3′ UTR, die Poly-Tail, die Spaltstelle, PAS und die Sequenzen stromaufwärts des PAS enthält. Im Gegensatz zu PCR, wonach die Gestaltung und Nutzung von Gen spezifische forward und reverse Primer benötigt 3′ Rennen nur zwei Gen spezifische verschachtelte forward Primer. PCR erfordert daher eine genauere Kenntnis der Nukleotidsequenz einer großen Region des Gens wird verstärkt^4,6. Da 3′ Rennen verwendet umgekehrt das gleiche Grundierung, dass Ziele der poly(A) tail für alle Polyadenylated RNA-Transkripte, nur die forward Primer gen spezifische, müssen somit nur erfordern Kenntnisse über eine deutlich kleinere Region der mRNA. Dies ermöglicht die Verstärkung der Regionen, deren Sequenzen nicht vollständig charakterisiert^4,7. Dadurch konnten 3′ Rennen verwendet werden, nicht nur um festzustellen, das 3′-Ende eines Gens, sondern um auch zu bestimmen und zu charakterisieren, große Regionen oberhalb des PAS, die einen erheblichen Teil der 3′ UTR bilden. Durch die Kombination von 5′ Rennen mit der modifizierten 3′ Rennen, die größere Teile der 3′ UTR und flankierenden Regionen umfasst, ist es möglich, vollständig sequenzieren oder Klonen eine gesamte mRNA-Transkript von 5′-Ende, deren Ende 3′⁸.

Ein Beispiel für die Anwendung der geänderten 3′ RACE ist die jüngste Identifizierung eines Romans CCND1-MRCK Fusion gen Abschrift von Mantel-Zell-Lymphom-Zell-Linien und Krebspatienten. Die 3′ UTR bestand aus Sequenzen aus der CCND1 und MRCK Gene und widerspenstigen MiRNA Verordnung⁹war. Die zwei verschachtelte CCND1 spezifische vorwärts Primer wurden ergänzend zu der Region unmittelbar neben und hinter der CCND1 -Stopp-Codon. Obwohl ganze Transkriptom Sequenzierung zusammen mit spezifischen Bioinformatic Hilfsmittel verwendet werden kann, um gen Fusionen innerhalb der 3′ UTR-¹⁰zu erkennen, können viele Labore fehlen die finanziellen Mittel oder Bioinformatic Know-how, um diese Technologie nutzen. Daher ist 3′ Rennen eine Alternative zur de-Novo -Identifizierung und Validierung von Roman Fusionsgene mit der 3′ UTR. In Anbetracht der drastische Anstieg der Zahl der gemeldeten Fusionsgene sowie die Transkripte durchlesen, 3′ Rennen ein mächtiges Werkzeug bei der Charakterisierung von Gen-Sequenzen^11,12geworden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese verschiedenen Sequenzen innerhalb der 3′ UTR sowie die Länge der 3′ UTR mRNA-Transkript Stabilität, Lokalisierung, Übersetzbarkeit und Funktion¹³beeinflussen kann. Zum Teil auf ein verstärktes Interesse bei der Zuordnung des Transkriptoms, gab es eine Zunahme der Anzahl der verschiedenen DNA-Polymerasen für den Einsatz im Labor entwickelt. Es ist wichtig, festzustellen, was Arten von Änderungen an die 3′ Rennen Protokoll in bestellen, nutzen Sie die verfügbaren Repertoire von DNA-Polymerasen erfolgen können.

Diese Arbeit Berichte Anpassung 3′ Rennen die gesamte 3′ UTR zuordnen, die PAS und die 3′ Ende Spaltstelle der ANKHD1 Abschrift mit Primer im Abschnitt ANKHD1 die Abschrift und zwei verschiedene DNA-Polymerasen verschachtelt.