Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Claudio Schmidli; Luca Rima; Stefan A. Arnold; Thomas Stohler; Anastasia Syntychaki; Andrej Bieri; Stefan Albiez; Kenneth N. Goldie; Mohamed Chami; Henning Stahlberg; Thomas Braun

doi:10.3791/57310

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생물학

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Published: July 27, 2018

doi:

10.3791/57310

Claudio Schmidli*^1,2, Luca Rima*¹, Stefan A. Arnold*^1,2, Thomas Stohler¹, Anastasia Syntychaki¹, Andrej Bieri¹, Stefan Albiez¹, Kenneth N. Goldie¹, Mohamed Chami³, Henning Stahlberg¹, Thomas Braun¹

¹Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum,University of Basel, ²Swiss Nanoscience Institute,University of Basel, ³BioEM lab, Biozentrum,University of Basel

Summary

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

Abstract

최근 기술적 진보 때문 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 급속 하 게 원자 해상도로 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 표준 방법 되고있다. 그러나, 단백질 분리 기술 및 그들에 대 한 샘플 준비 방법 병목 현상 유지. 개별 단백질 입자의 비교적 적은 수 (몇 백만에 100000) 단일 입자 그들 접근, 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원칙 하에 의해 단백질의 고해상도 분석에 대 한 이미지 필요 가능.

소형된 종이 blotting 무료 EM 그리드 준비 방법 샘플 사전, EM 그리드 못쓰게 조화와 nanoliter-볼륨 샘플의 사용 후 처리에 대 한 제공 됩니다. 메서드를 사용 하 여 분배 시스템 하위 nanoliter 정밀 제어 액체 통풍 관 및 EM 그리드 못쓰게, 플랫폼 위에 EM 그리드 및 선택-및-다이빙-메커니즘 샘플에 대 한 상대 습도 그로 인하여 결정 격자 온도 제어 vitrification입니다. 곳을 알아내는-EM, EM 격자 온도 제어 스테이지에 배치 및 모 세관으로 발음 하는 샘플은. 모 세관 팁 격자 표면에 근접에서 위치, 그리드 샘플 로드 되 고 초과 microcapillary로 다시 발음입니다. 그 후, 샘플 영화 안정 이며이 슬 포인트를 기준으로 플랫폼 온도 오프셋에 의해 통제 하는 제어 물 증발에 의해 약간 박 형. 주어진된 시점에서 선택 식이 메커니즘 샘플 vitrification에 대 한 액체 탄 액된 EM 그리드 전송 빠르게 실행 됩니다. 또한, 샘플 컨디셔닝 방법 부정적인 얼룩 (NS) 그들에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨을 준비 사용할 수 있습니다.

방법론 크게 샘플 소비 하 고 기존의 방법에서 사용 필터 종이 blotting 단백질, 잠재적으로 유해한 접근을 피하십시오. 또한, 필요한 샘플의 소문자 금액 수 있습니다 빠른 샘플 컨디셔닝, “시각적 proteomics,”에 대 한 단일 셀 세포 또는 정량 분석을 위한 “무손실” 총 샘플 준비와 함께 같은 새로운 실험 전략을 복잡 한 샘플입니다.

Introduction

하드웨어 및 소프트웨어 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 대규모 최근 몇 년 동안 선진 했다. 개선 사항을 “해상도 혁명”¹^,² 도를 포장 하 고 근본적으로 구조 연구를 변경. Cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)³^,⁴, 방사선 민감도 감소 방지 하는 동안 생리 적 조건에 가까운 아래 생물 샘플의 준비를 허용의 도래와 함께 시작 하는 혁명 높은 진공에 샘플 증발 전송 전자 현미경⁵ 다음 년에서 증분 기술 진보는 점차적으로 달성 해상도 증가. 이러한 혁신 중 필드-방출 총⁶^,⁷, 적용 되었고, 더 최근에, 최대 가능성 방법⁸^,⁹등 데이터 분석 알고리즘을 개선. 직접 전자 탐지기 카메라¹⁰^,¹¹^,^,¹²¹³, 영화 모드 이미징 및 동반 소프트웨어 개발¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶ ^, 단일 입자 분석 (대 한 검토 보고 챙, Grigorieff, 외. 생물 학적 샘플에 대 한 원자 해상도 달성 하는 데 필요한 마지막 돌파구를 제공 하는 ¹⁷, ¹⁸). 곳을 알아내는-그들의 중요성 최근 개척자의 3 화학을 위한 노벨상의 포상에 의해 인식 되었다.

가장에 의해 생물 학적 샘플 이미지, 샘플 (이후 “그리드 준비” 라고도 함) 안에 그리드를 로드 하는 데 사용 하는 방법 결과 샘플 레이어 (i) 충분히 얇은 인지 확인 해야 합니다 (< 100 nm) 흩어져 탄력에 의해 광범위 한 소음을 방지 또는 곱하기 전자 현미경의 높은 진공을 견 디는 전자, (ii)와 (iii) 방사선 손상에서는 생체를 보호 합니다. 두 가지 주요 방법 이러한 빌드하거나 수행 하는 데 사용 됩니다: 부정적인 얼룩(NS)¹⁹^,²⁰ 절차 (그림 1A) 얇은 탄소 필름 샘플을 흡착, 비정 질 중 금속에는 생체를 포함 그리고 어셈블리 공기에 건조를 허용 합니다. 이것은 간단 하 고 빠른, 그리고 로드 EM 격자 (이후 “샘플 격자” 라고도 함)는 쉽게 저장 하 고 시간의 연장된 기간에 대 한 유지 될 수 있다 (일반적으로 년). 가장, 준비 NS 인해 높은 콘트라스트를 전시 하 고, cryo-준비 보다 더 높은 전자 복용량을 용납 하지만 해상도 약 20 Å. Cryo-EM 절차 (그림 1B) 고용 홀리 탄소 지원 제한. 샘플 솔루션의 박막 구멍에 걸쳐 스팬 및 EM 그리드 제, 일반적으로 액 화 탄을 급속 하 게 그것은-150 ° c에 뛰어들었다 결과 아 몰 퍼스, vitrified, 50 ~ 100 nm 두꺼운 필름 지원 구멍에서 솔루션의. 이 얇은, 비정 질 영화 견 디는 전자 현미경에서 높은 진공으로, 이상적인 케이스에서 그들의 네이티브 국가에서 생물 학적 구조 합니다. 프로시저에서 고해상도 이미지를 생물 학적 샘플 수 있습니다. 그러나, 샘플 그리드 유지 되어야 한다 온도 아래에서-150 ° C 깡통을 피하기 위해 모든 시간에. 때문에 낮은 온도, 하지만 대비 상대적으로 높은 전자 복용량을 사용 하 여 이미지 수 이며 신호 대 잡음 비율 역시 낮은. 따라서 평균 기술 대비 증가 고용 하 고, 고해상도 3 차원 (3D) 지도 제공 하는 샘플은 다른 각도에서 몇 군데, 개축 될 수 있다. 가장 일반적으로 사용 하 고 매우 성공적인 지금 3D 재구성 방법은 단일 입자 접근. 최근 검토 쳉 여러분¹⁸참조.

부정적인 얼룩 가장 (NS-EM) 인지 검사 및 품질 관리에 대 한 중요 한 높은 콘트라스트 필요할 때 제한 된 양의 샘플을 사용할 수 있는 경우 (흡착 탄소 필름에 일반적으로 집중 하 고 샘플). 단일 입자 cryo-그들은 단백질 구조의 고해상도 3D 복원에 대 한 겨냥 한 경우 골드 표준 방법입니다.

그림 1: 원리의 가장 그리드 준비 및 클래식 (패널 A, B)와 미세 접근 (패널 C, D) 사이 비교. A) 클래식 NS-EM 그리드 준비: 샘플의 µ L 3에 대 한 지속적인 탄소 필름 (이후에 ‘NS-EM 격자’ 라고도 함)으로 덮여는 그들 격자에 손으로 pipetted는 (i). 약 10 부 화 후 s, 필터 종이 얇은 물 필름에 흡착된 생체를 떠나 측면 (ii)에서 과잉 액체를 멀리 오 점 하는 데 사용 됩니다. 그 후, 단백질 중 금속 소금 솔루션, 예를 들어, 20 2 %uranyl 아세테이트 incubated s (iii), 그리고 다시 액체 필터 종이 (iv)를 사용 하 여 측면에서 blotting에 의해 제거 됩니다. 마지막으로, EM-그리드 건조 한 공기에 남아. B) 클래식 cryo-EM 그리드 준비: 샘플에 대 한 3 µ L 홀리 탄소 필름에 손으로 pipetted는. 얇은 샘플 영화를, 과잉 액체 종이 blotting 얼굴-에 의해 하나 또는 양쪽 (ii)에서 제거 됩니다. 마지막으로, 격자는 급속 하 게 속으로 뛰어들었다 vitrification (iii)에 대 한 액체 탄. C) cryoWriter 설정을 사용 하 여 NS-EM 그리드 준비: A 5 nL 볼륨 (i) microcapillary를 사용 하 여 샘플 재고에서 발음. 샘플 컨디셔닝, microcapillary 팁은 컨디셔닝 솔루션으로, 예를 들어, 2% 염화 아세테이트 포장 되어있습니다. 이온 및 작은 분자 확산 (ii)로 교환 됩니다. 참고는 microcapillary의 크기는 전체 프로세스를 구동 하는 보급을 보장 하는. 단백질 소금 이온 보다 훨씬 낮은 확산 상수 있고²⁴를 크게 잃지는. 마지막으로, 샘플 격자에 적절 하 게 이며 (iii) 건조 수 있었습니다. D) cryoWriter 기반 방법을 사용 하 여 곳을 알아내는-EM 그리드 준비의 원칙: 홀리 탄소 필름으로 커버는 그들 격자 온도 제어 플랫폼의 표면에 놓이고 핀셋에 의해 개최. 플랫폼의 온도 노점 온도 그리드 환경에서 오프셋에서 제어 됩니다. 그리드 샘플을 포함 하는 microcapillary를 기준으로 이동 하 고는 microcapillary 그리드 위에 몇 마이크로미터까지 낮춘 다. 그 후, 샘플의 몇 nanoliters는 적절 하 게 그것에서 무대 나선형 패턴;에 이동 하는 동안 과잉 액체는 다시 발음 (i). 못쓰게는 그들 격자 후는 microcapillary 철회 하 고 격자 온도 제어 플랫폼에서 (그 후이 슬 포인트 (DP) 단계 라고 함) 제어 양의 샘플 증발을 허용 하도록 짧은 시간 동안 남아 있습니다. 동결 하는 식이 대 한 그리드 빠르게 핀셋 (ii)를 사용 하 여 스테이지에서 철수, 수직 위치에 90 °에 의해 뒤집힌 이며 제 목욕 (iii) (이후 ‘ 선택 및 식이 ‘ 메커니즘 이라고 함)으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

불행히도, NS 및 곳을 알아내는-EM 사용 그리드 준비 방법은 그들은 발명 이후 크게 개선 하지 했습니다. 현재 단점 높은 샘플 소비 (1 mg/mL 단백질의 약 3 µ L) 이며 샘플의 다량 (> 99%) (그림 1A, B)를 잃었다. 또한, 클래식 cryo-그들에 대 한 격자를 준비 하는 데 사용 방법은 단백질에 대 한 가혹한 절차: 먼저, 그것은 포함 한 광범위 한 얼굴에 종이 blotting 단계 (그림 1B, ii), 그리고, 둘째, 단백질은 공기-물 인터페이스에 노출 되 ²¹의 상당한 양에 대 한입니다. 여기, 사전 조건 샘플에 대 한 다른 방법, 샘플 그리드 준비 및 사후 처리 (그리드 건조 또는 vitrification) NS-EM (그림 1C) 또는 곳을 알아내는-EM (그림 1D)에 대 한 제공 됩니다. “CryoWriter” 라는 자체 내장된 설치 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원리를 사용 하 여 발음, 조건 샘플, 피하 종이 완전히 더 럽 히 고 얇은 샘플에 대 한 대체 방법을 제공 하는 걸을 곳을 알아내는-EM. 그것은 크게 샘플 소비를 감소 하 고 전체 샘플 준비에 사용자 제어를 향상. 또한, 메서드 수 소설 실험적인 응용 프로그램; “단일 셀 시각적 proteomics”²²^,²³^,^,²⁴²⁵라는 접근 방식에서 개별 셀의 격리 된 생물 학적 구성 요소 작성 등

Protocol

“CryoWriter” (그림 2세부 정보 이전 작업24,,2627참조;) 또는 동등한 계측은 다음 프로토콜에 대 한 필요. 주요 부품 및 소모품에 대 한 공급 업체의 목록 테이블의 자료에서 주어진 다. 1. 부정적인 얼룩 (NS) 그리드 준비 악기를 켜고 소프트웨어를 시작. (주사기 펌프 컨트롤러, 자동화 된 단계, 감시 카메라 및 노점 단계) 모든 필요한 모듈을 초기화 합니다. 샘플 지원 및 노점 단계 냉각 하십시오. 필요한 경우 노점 단계 온도 규제 확인이 슬 포인트 위에 1-2 ° C.참고: 무대는 PID 컨트롤러와 상업 Peltier 장치에 의해 냉각 됩니다. NS NS (예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 2% methylamine tungstate)의 100-150 µ L을 100 또는 200 µ L PCR 튜브를 작성 하 여 준비 합니다. 장소는 악기의 냉각된 샘플 지원에 관. 위치는 샘플입니다. 샘플을 넣어 (0.5-1 µ M) 100 또는 200 µ L PCR 튜브에. 50 µ L의 샘플을 사용할 수 있는 경우 면도날으로 PCR 튜브의 아래쪽을 잘라 사용 하 여 샘플으로 잘. 이렇게 하면은 microcapillary 샘플을 쉽게 도달할 수 있다.참고: 샘플을 발음을 나중에 사용 하는 microcapillary 약간 기울이면 여행 높이 z 축 방향은 제한 때문에 샘플 100 또는 200 µ L PCR 튜브에서 발음 하기 쉬운입니다. 증발을 방지 하기 위해 악기에서 냉각된 샘플 지원에 PCR 튜브/컨테이너를 놓습니다. 실내 온도;에서 현미경 단계 최고 인큐베이터에서 잘 접시에서 샘플을 발음 하는 또는, 냉각은 잘 번호판에 대 한 구현 되지 않습니다. 위치를 정의 합니다. 전동된 xy 스테이지 및 선형 x, y 및 z 축 단계는 microcapillary를 위한 소프트웨어 제어 버튼을 제어 하는 cryoWriter 조이스틱을 사용 합니다. 카메라를 사용 하 여 모 세관의 위치를 확인 하십시오. 샘플 저수지에는 microcapillary를 이동 합니다. 팁 샘플 액체에 담가 하 고 “샘플”로이 위치를 저장 합니다. microcapillary NS PCR 튜브에, NS 솔루션으로 끝을 담가 이동한 “얼룩”로이 위치를 저장 합니다. Microcapillary 약 100 µ m는 그들 격자 배치 될 및 “grid_save”로이 위치를 저장 슬롯의 중심 위에 놓습니다. 샘플을 발음 하 고 NS-그들에 대 한 조건. 아직 설치 하지 않은, 정밀 주사기 펌프에 10 µ L 주사기 (0.46 m m 내경)를 탑재. 30 cm 긴 융합 된 실리 카 microcapillary (외경 360 µ m, 내경 150 µ m) 주사기 콘센트의 한 쪽 끝을 붙입니다. 보도 맞는 커넥터를 통해 다른 긴 테이퍼 짧은 (5 cm)에 microcapillary의 끝 microcapillary에 연결 합니다. 짧은 microcapillary의 테이퍼 팁 분배 팁을 형성 한다. Degassed 이중 증 류 물 (ddH2O; 시스템 액체) 주사기와 기포의 형성을 피하기 위해. 분배 시스템 액체의 nanoliters의 몇 수만 하 고 보풀 조직으로 microcapillary에서 모든 상품을 제거 합니다. 저장 된 샘플 위치에 두 번 누릅니다. 이 예제에는 microcapillary를 잘 배치합니다. 모 세관 이동 하는 동안 3 x 0.5 분배 시스템 액체 microcapillary 팁 (참고 2 참조) 거기 갇혀에서 기포를 방지 하기 위해 샘플에 몰입 하기 직전의 nL. 샘플의 aspirate 5 nL입니다. 저장 된 NS 위치에 두 번 누릅니다. microcapillary 샘플 컨테이너에서 철수 하 고 NS 저수지로 자동으로 이동. 모 세관 이동 하는 동안 수동으로 3 x 0.5 분배 팁 공기는 되도록 저수지에 몰입 하기 바로 전에 샘플 액체의 nL 거품 (참고 2 참조).참고: 중요: (1) 포부 또는 분배 모드에서에서 전환할 때 거기에 작은 손실 때문에 피스톤 스트로크 주사기 펌프의 기어에 반발 하. 제조 업체에 따라 새로운 단위의 반발 7과 12 µ m 사이 속 인 다. 0.46 m m 배럴 직경을 가진 우리의 주사기에 대 한이 1-2 nL 변환 됩니다. 따라서, 1-2 nL 수 수 “적절”, 샘플 실제로 적절 하 게 하기 전에. 일반적으로, 작은 물방울 3 0.5 microcapillary 팁 종료 시작 nL 분배 단계. (2) 위/아래 샘플 갇혀 공기 방울이 것 분배 덜 정확 하 고 샘플 컨디셔닝 확산 방지. Microcapillary 샘플 버퍼 및 노즐 형상에 따라 3-12 분에 대 한 몰입을 둡니다.참고: 높은 소금 또는 인산 염 농도, 버퍼에서 필요한 침수 장시간. (상대적으로 신속 하 게) NS (훨씬 느리게) 확산 아웃 버퍼 (비교적 빠른) 소금과 단백질 동안 샘플 플러그로 확산. 이 때 로드 그리드 마른 crystallizing에서 그들을 방지 하는 샘플에서 버퍼 소금의 농도 낮춘 다. 또한, 인산 NS와 함께에서 한 침전을 형성 경향이 있다. 그리드를 준비 하 고 입금 조건된 샘플의 자리. 샘플은 조절 되 고, 접착 테이프 및 PDMS 블록의 조각을 고는 PDMS의 상단 측면 적용 및 먼지는 되도록 접착 테이프를 제거 하 여 청소. 배양 접시에서 PDMS 블록을 넣어.참고: 새로운 PDMS 블록 클린 룸에서 가져옵니다. 한 그리드를 신중 하 게 선택 (예를 들어, 잘라내기, 200 또는 400 메쉬 Parlodion/C 필름으로 코팅). 핀셋으로만 격자의 가장자리를 터치 해야 합니다. 위쪽으로 향하게 하는 탄소 필름으로 깨끗 한 PDMS 블록에 놓습니다. 장소 공기 글로우 방전 장치 및 광선 그리드와 PDMS 블록 20 방전 0.4 mbar에서 100 W 파워 s. 닫힌된 페 트리 접시에 그리드를 저장 합니다. 더 이상 글로우 방전 시간 일반적으로 격자에 예금 된 샘플 볼륨의 큰 확산으로 이어질. 그 결과, 얼룩 레이어 됩니다 얇은 (약한 얼룩). 1 분 전에 집중 시간, cryoWriter 핀셋으로 글로우 방전 그리드를 파악. 전자석; 설정 되어 있는지 확인 그렇지 않으면 그것에서 켤 소프트웨어. 전자석에 핀셋을 탑재 하 고 수동 micromanipulator 나사를 사용 하 여 노점 무대, 탄소 필름 쪽에서 평면 그리드를 정렬. 노점 단계 온도 규제 확인 샘플 로드 된 후 증발의 비율을 줄이기 위해 1-2 ° C 이슬점 이상. 침수 시간을 때, “grid_save” 두 번 클릭. Microcapillary 팁 격자 표면 위에 안전 하 게 배치 됩니다. 수동으로 그리드 접촉 microcapillary 팁을가지고. 10 µ m에 의해 노즐을 들어올리고 중심 위에 위치 합니다.주의: 세제를 포함 하는 일부 샘플 때 액체는 낮은 표면 장력 때문에 적절 하 게는 microcapillary의 외부 표면에 따라서 이동 하는 경향이 있다. 이러한 손실을 방지 하기 위해 격자 표면에 매우 가까울 중요 하다. 5 분배 격자에 샘플의 nL. 때 급속 한 증발은 microcapillary 끝에 일어난, 건조 한 일에 또한 천천히 샘플은 매우 끝에 때까지 걸 수 있고 다음 5를 신속 하 게 분배 nL. microcapillary을 철회 하 고 노점 단계 (DP-단계)에 천천히 건조 조건된 샘플. 샘플 자리는 건조 되 면 그리드를 제거 하 고 실내 온도 눈금 상자 또는 페 트리 접시에 그것을 저장. 500 분배는 microcapillary에서 시스템 액체의 nL 보풀 조직으로 그것을 제거 하 고. 5 번 에탄올, 세제 또는 1 M NaOH와 모 세관을 플러시. 이 청소는 다른 예제와 함께 사용할 수 있도록 microcapillary. 2. 곳을 알아내는 그리드 준비 악기와 샘플을 준비 하려면 단계 1.1 ~ 1.5 위에서 설명한. NS 필요 하지 않으면, 1.3 및 1.5.2 단계를 생략 합니다. 샘플 버퍼 교환 또는 곳을 알아내는-그들에 대 한 샘플 투 석 하 여 조건, 예를 들어, 버퍼의 농도 줄이기 위해 소금 또는 소개 첨가제 (예, 트 레 할 로스, 세제) 사용 원하는 버퍼 대신 NS 1.3 및 1.5.2 단계에서. 표준 cryo 컨테이너에서 액체 탄을 준비 합니다. 탄 컵, cryo 상자 홀더, 그리고 거미를 조립 하 고 액체 질소; 테두리에 제 컨테이너 채우기 보통 약 200 mL를 필요합니다. 탄 컵 냉각은 액체 질소의 무료 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 탄 가스 병 연 탄 컵에 가스 시내를 천천히 하자. 레벨은 2-3 m m 상단; 아래 때까지 액체 탄을 채워 보자 이 몇 분 정도 걸립니다 이며 약 5 mL의 액체에 탄. 곳을 알아내는 상자를가지고 고 제 컨테이너에서 무료 슬롯에 배치. 거미를 제거, polystyrol 뚜껑 위에 놓고는 cryoWriter에 장착에 제 컨테이너를 놓습니다. 글로우 방전은 그들 격자입니다. 접착 테이프와입니다 (PDMS) 블록의 조각 하 고 위쪽 PDMS 적용 (먼지 제거) 접착 테이프를 제거 하 여 청소. 배양 접시에서 PDMS 블록을 넣어. 조심 스럽게 눈금 상자에서 grid를 선택 합니다. 핀셋으로만 격자의 가장자리를 터치 해야 합니다. 위쪽으로 향하게 하는 홀리 탄소 필름으로 깨끗 한 PDMS 블록에 놓습니다. 장소는 PDMS 청소기와 플라즈마-청소는 플라즈마에 그리드와 그리드 표면 (예: 사용 75% Ar/25% H2 전력 50 W, 압력 25 mTorr)를 차단 합니다. 페 트리 접시에 글로우 방전 그리드와 PDMS 블록을 배치 합니다. 악기에 위치 격자 CryoWriter 핀셋으로 글로우 방전 그리드를 파악. 전자석; 설정 되어 있는지 확인 그렇지 않으면 그것에서 켤 소프트웨어. 전자석에 핀셋을 탑재 하 고 수동 micromanipulator 나사를 사용 하 여 최대 무대, 탄소 필름 측에 평면 그리드를 정렬. “Grid_save”를 더블 클릭 합니다. 팁은 격자 표면 위에서 약 10 µ m microcapillary 위치를 조정 합니다. 그는 microcapillary 자유롭게 이동할 수 있습니다 그리드에 걸쳐 어디서 나, 그것을 건드리지 않고도 필요한 몇 마이크로미터는 microcapillary을 철회 하는 경우 다는 것을 확인 하십시오. 격자의 중심으로 다시 이동 하 고 “그리드”로 새로운 위치를 저장 합니다.주의: 올바른 명명 하는 것은 작동 하도록 매크로 스크립트에 대 한 필수입니다. 샘플 및 플런지 고정 표를 작성 합니다. 플러시 시스템 액체의 nanoliters의 몇 가지 수만 microcapillary 고 보풀 조직으로 microcapillary에서 모든 상품을 제거 합니다. 매크로 스크립트를 시작 합니다. 매크로 다음 단계를 수행 합니다. 5 분배 (팁에서 모든 기포를 제거) 하는 nL 샘플 위치 이동. 샘플의 aspirate 65 nL입니다. 5 달 샘플 튜브에 다시 nL. 이 시스템에 대 한 반발 계정과 동기화 된 면, 즉허용. 그 분배를 보장와 동시에 운동 시작을 무대에. “그리드” 위치로 이동 합니다. ‘글 패턴’, 동시에 45 분배 그리드에서 이동 하는 microcapillary를 시작 샘플의 nL. 이후에, 그것은 또 다른 10 µ m, 낮은 눈금의 중심에는 microcapillary를 다시 이동 고 초과 샘플 액체를 철회. microcapillary을 철회 하 고 전자석을 끄십시오. 이 족집게와 초기화 식이 동결 해제 합니다. 족집게를 신중 하 게 플런저에서 자기 어댑터를 출시. 빨리 cryo 상자가 포함 된 제 용기에 탄 컵에서 그리드를 전송 하 고 무료 슬롯에 그리드를 배치. 3. 단일 세포 Lysate 준비 microcapillaries electroporation 준비.참고: 테이퍼 (레이저 뽑아와 검사) 융합 된 실리 카 microcapillaries 코팅 가늘게 과정 탄은 어디 팁 제외 하 고 외부에 보호 구체의 코팅을 했습니다. 전도성 층으로 microcapillaries 코트, 탑재 그들 45 °의 각도에서 금속 레일에 팁을 위쪽으로 포인팅. Uncoated 폴 나중 고용 언론 적합 커넥터와 최고의 물개를 형성 알루미늄 호 일, 팁의 하단 (2 cm)를 방패로 사용 합니다. 스퍼터 예금 20의 끈끈한 층 Ti/W, 및 태평양 표준시의 다음 200 nm 두께 층. 소수 microcapillary 팁을 확인 합니다. EtOH에 1 dodecanethiol의 1 분 솔루션을 준비 합니다. 글로우 방전 0.4 mbar에서 100 W 전력으로 1 분 동안 공기에서 microcapillary. 몇 시간 (이상적으로 하룻밤) 1 M 솔루션 1-dodecanethiol의 microcapillary의 끝을 젖어.참고: 사용 하기 전에 어느 날 갓 팁 준비 하 최상 이다. 새로운 microcapillary를 설치 합니다. 1 dodecanethiol 솔루션에서 제거 하는 microcapillary, 에탄올과 외부를 헹 구 고 에탄올 주사기를 사용 하 여 내부를 플러시.참고: 없는 기능성된 microcapillaries을 사용할 수 신속 하 게 발광 방전는 microcapillary의 팁 및 PDMS와 황산의 혼합물은 상업적인 자동차 창 처리의 한 방울에 그것을 찍어. 결과 소수 기능화가 아니다 만큼 좋은 1-dodecanethiol, 그러나 일반적으로 충분 한. 모 세관 커터 uncoated 끝 쪼개참고: 깨끗 한 컷 언론 적합 커넥터와 좋은 물개를 위해 중요 하다. 이쑤시개를 사용 하 여 유리와 폴 코팅 사이 형성 하는 구체의 코팅 모 세관 당기 중 레이저에 의해 점화 했다 때 날카로운 보더에 실버 붙여넣기를 적용.참고:이 보강 필요 Pt 코팅은이 지역에서 매우 약한 하 고 전기 전도 수 쉽게 무 너 뜨 리는. 아세톤과 microcapillary의 폴 끝을 씻어. 끝에 아세톤의 작은 방울을 두고 언론 적합 커넥터의 구멍에 삽입. 좋은 물개를 형성 하는 가벼운 압력을 적용 합니다. Microcapillary 위치를 보정. 악기를 켜고 단계 1.1에서에서 설명 된 대로 소프트웨어를 시작. 또한, 현미경 카메라와 함수 발생기를 초기화 합니다. 현미경에 슬라이드 홀더에 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 낮은 유리 슬라이드와 센터 microcapillary 그것 그것까지 현미경 목표 현미경 카메라 보기에 나타납니다. X 축 및 y 축 선형 단계를 사용 하 여 이미지의 중심에는 microcapillary의 팁의 위치. 그런 다음 천천히 낮은 팁 약간 유리 슬라이드를 건드리면 때까지.주의: 최종 접근 방식으로 매우 작은 단계 (5 µ m)을 선택 합니다. 그렇지 않으면, 팁은 손상 될 수 있습니다. “노즐 보정” 버튼을 누릅니다. 이 취소는 microcapillary 40 mm, 그리고이 위치 세트 홈 위치. 스탬프 PDMS 조각과 이토의 준비 슬라이드 믹스 PDMS와 10:1 비율, crosslinker 교 잡 인큐베이터 또는 유사한 장치에 몇 시간 동안 깊이 약 2-3 m m. 빵 60 ° C에서 큰 페 트리 접시에 부 어. 망치와 우표 (직경 12 m m), PDMS 층에 구멍을 절단. 나중에에 2 cm 긴 사각형 또는 사각형 현미경 슬라이드에 스탬프 조각을 구멍을 포함 하 여 메스를 사용 합니다. 일반적으로, 두 개의 스탬프 조각 한 현미경 슬라이드에 거치 된다. PDMS 조각과 이토 슬라이드 먼저 세제 그리고 70% 에탄올으로 세척. 60 ° c.에 오븐에 있는 장소, 페 트리 접시에, 젖은 고 에탄올 완전히 증발 글로우 방전 0.4 mbar에서 100 W 전력으로 1 분에 대 한 이토 슬라이드 한 다음 코팅 솔루션 (예를 들어, 폴 리-L-리 신 (PLL))의 1 mL를 적용. 5 분 동안 품 어, 피 펫, 솔루션을 제거 하 고 ddH2오 약간의 1 mL 적용 1 분 동안 교 반 한 다음 ddH2O를 피 펫을 사용 하 여 제거. 60 ° c.에 건조 하는 슬라이드를 하자 세포 배양을 준비 합니다. 따라 표준 부착 셀 자란 프로토콜 (예를 들어, 아놀드, 외. 24 , 25). 정상적인 분할/뿌리고 실행 중에 이토 셀 씨. 이토 갓 PLL-코팅 슬라이드 고 PDMS 추가. 방수 물개를 형성 하기 위하여 압력을 적용 합니다. 이 그들의 기지로 슬라이드 작은 우물을 생성합니다. PDMS 우물에 신선한 매체에 셀의 약 300 µ L를 추가 합니다. 시드 밀도 잘 당 약 75000 셀 있어야 합니다. 표준 조건 하에서 1-2 일에 대 한 이토 슬라이드를 품 어. 세포 세포의 용 해 실험에 대 한 준비: 미리 몇 밀리 리터 electroporation 버퍼 (예를 들어, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS))의 따뜻한. NS-EM 그리드 준비에 대 한 설정 준비참고: 설정 준비 하기 위한 세부 단계 1.1-1.5 (NS) 또는 단계 2.1-2.4 (cryo)에 표시 됩니다. 여기 우리는 NS 준비를 위한 가장 중요 한 단계를 설명합니다. NS NS (예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 2% methylamine tungstate)의 100-150 µ L을 100 또는 200 µ L PCR 튜브를 작성 하 여 준비 합니다. 장소는 악기의 냉각된 샘플 지원에 관. microcapillary NS PCR 튜브에, NS 솔루션으로 끝을 담가 이동한 “얼룩”로이 위치를 저장 합니다. 표준 세포 매개 변수, 예를 들면, 세포 전압을 로드 합니다. 인큐베이터에서 이토 슬라이드를 현미경 삽입에 마운트. 알루미늄 삽입에 슬라이드를 해결 하 고는 이토 사이 전기 접촉 되도록 2 개의 나사를 사용 하 여 슬라이드와 전기적으로 접지 된 알루미늄 프레임의 코팅. 세포 배양 매체를 제거 하 고 electroporation 버퍼의 300 µ L로 두 번 세척. Electroporation 버퍼에 셀을 계속. 장소는 알루미늄 설정에 라이브 셀 보육 단계에서 이토 슬라이드를 들고 삽입 합니다. 현미경 보기에서 세포 배양을 찾아서 셀 영역을 선택 합니다. ITO 표면에 끝을 접근 부드럽게 터치, 다음 팁 100 µ m를 철회 하 고 “셀”로 위치를 저장. 신속 하 게 세포 배양을 두고 플러시 시스템 액체의 nanoliters의 몇 가지 수만 microcapillary 팁 후 다시 세포 배양에 넣어. 공기 거품에 갇혀 있다 되도록 PDMS 우물에 집중 하는 동안 몇 가지 nanoliters을 분배. ITO 표면에 부드럽게 접근 (처음 위치 “세포”, 즉에 수 있어야 합니다., 100 µ m 표면 위에). 접촉, 시 팁 10 µ m을 철회. 세포에 대 한 인접 셀을 선택 합니다. 대상된 셀 위에서 microcapillary의 끝을 놓습니다. 단일 세포 세포의 용 해에 대 한 매크로 스크립트를 시작 합니다. 셀 성공적으로 lysed 되었습니다 후에 이름에 microcapillary 위치를 이동 해야 합니다. 이 NS 저수지 (NS-엠), 염 버퍼 (cryo-EM) 또는 EM 그리드 (cryo-EM) 될 것입니다. 맞춤법 오류를 방지 하 고 “확인”을 누릅니다. 매크로 사용자 개입 없이 진행: i) 현미경 단계와 세포 문화 100 µ m, 왼쪽에 대상된 셀의 스냅숏을 이동 ddH2O 시스템 액체의 촬영, 그리고 50 nL는 microcapillary에서 적절 하 게 됩니다. 이 배 수량 및 높은 소금 버퍼를 dilutes 하 고 셀 삼투성 압력을 적용 합니다. 단계 ii)는 다시 대상된 셀 위에 팁의 위치를 다시 이동 합니다. 미리 정의 된 전압 버스트 적용 되 고 500 밀리초 후 펌프 시스템 3 발음 시작 2 µ L/min의 유량에서 샘플의 nL. iii) 무대 이동 왼쪽으로 다시 검사를 셀 수 있도록 합니다. 사용자 입력에 대 한 묻는 창이 나타납니다. 세포 단계 성공 했는지 여부를 말한다. 대답은 아니, 정복, 플러시는 microcapillary 고 새로운 셀을 대상. 대답은 ‘ 예, 제거 (lysed) 셀의 스냅샷을 촬영 하 고 이후에 microcapillary 3.8.1에 지정 된 위치로 이동 합니다. NS 또는 버퍼 저수지 인 경우 표준 사용자 인터페이스를 사용 하 여 3 x 0.5를 분배 하는 microcapillary 동안 액체의 nL 아무 공기 방울을 이동. 팁은 매크로 의해 저수지 액체에 포장 되어있습니다.참고: 샘플 조건 섹션 1.6.9-NS-EM 또는 곳을 알아내는-그들에 대 한 섹션 2.2-2.6 로더 1.7.9에에서 설명 된 대로 격자를 준비를 계속할 수 있습니다. 아래, NS-그리드 준비에 필요한 단계는 설명 했다. Microcapillary 노즐 형상에 따라 8-12 분에 대 한 몰입을 두고합니다참고: 버퍼에 높은 인산 염 농도 조절에 대 한 긴 침수 시간을 필요합니다. 5 분배 조건된 셀 격자에 lysate의 nL. microcapillary을 철회 하 고 하자 노점 단계 (DP-단계)에 천천히 건조 조건된 샘플 노점 온도 이상 1-2 ° C를 통제. 그리드를 제거 하 고 실내 온도 눈금 상자 또는 페 트리 접시에 그것을 저장.

Representative Results

“CryoWriter” 설치 그림 1C, D에에서 제안 된 소형된 EM 그리드 준비 절차를 테스트 하기 위해 ( 그림 2에 묘사 된) 개발 되었다. 그림 2 A 역 형광 현미경에 장착 하는 다양 한 구성 요소에 대 한 개요를 보여 줍니다. 세포 배양 모듈 현미경;의 왼쪽에 설치 EM 그리드 준비에 대 한 모듈은 오른쪽에 있습니다. 세포 배양 모듈 (그림 2B)는 가벼운 현미경에 의해 부착 진 핵 세포의 성장 및 세포 배양의 라이브 셀 이미징 있습니다. 개별 세포는 삼투성 충격, electroporation 및 (그림 2B, 그림 6A) microcapillary,2425에 셀 내용의 포부의 결합된 한 활동에 의해 lysed. Aspirated lysate 샘플 다음 준비 격자에 대 한 NS 또는 곳을 알아내는-EM을 사용할 수 있습니다. 또는, PCR 튜브에서 재고 단백질 솔루션 샘플 소스를 될 수 있습니다. Microcapillary (그림 2B) 고용 발음 하 여 하위-nL 정밀도와 적절 하 게 샘플 볼륨을 수 있도록 높은-정밀 펌프 시스템에 연결 됩니다. 자세한 프로토콜에서 모든 샘플 처리가이 microcapillary 또는 중요 한 샘플 전송 없이 자체 EM 격자에 수행 됩니다. 예를 들어 동일한 microcapillary 개별 진 핵 세포를 lyse, lysate를 발음, 그것, 그리고 마지막으로 분배 EM 격자에 aliquots에 사용 됩니다. EM 격자에 그것을 정확 하 게 제어 (그림 2C)의 온도 허용 하는 움직일 수 있는 DP 단계 그리드 준비 모듈에 의하여 이루어져 있다. NS-가장에 대 한 준비 샘플 격자 수 다음 단순히 차가운 단계에서 제거 되며 실내 온도에 공기에서 건조를 허용. 그러나, 다음 발생할 수 있는 소위 커피 고리 효과 양적 가장 단백질 ‘입자’ 계산 됩니다에 대 한 피할 필요가 있다. 이렇게 하려면, 격자는 액체의 증발 속도를 점차적으로 증가 온도 기울기를 사용 하 여 DP 단계에 천천히 건조 수 있습니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 격자의 온도 노점; 가까이 보관 약 8 ° C의 양수 오프셋을 선택 하면 필요한 경우 센서에 의해 모니터링 될 수 있다 이다 박막 및 숱이 대 한 샘플 액체의 제어 증발 수 있도록26. 선택한 숱이 시간이 후 선택 식이 메커니즘을 활성화 하 고 샘플 vitrified (그림 2C). 참고가 폭락 메커니즘 실내 온도에 저장 되는 NS EM 격자에 대 한 필요 하지 않습니다. 그림 2: cryoWriter 설치의 개요. A) cryoWriter 설정의 개요는의 역 빛-(1) 현미경에 장착. B) 영역의 삽입 샘플 조작 및 세포 세포의 용 해 소형된 PDMS 기반 셀 문화 접시 (4) 위에 위치에 대 한 microcapillary (3) 패널 A. 셀 자란 구획 (2), 왼쪽에 표시. C) 영역의 삽입 패널 A. ‘ 선택-및-식이 ‘ 메커니즘에서 오른쪽에 표시. 홀리 탄소 필름 EM 격자 (5) 핀셋 (6)의 끝 사이 탑재 하 고 온도 제어 스테이지 (7), 주요 텍스트에서 노점 단계 (DP-단계)으로 직접 접촉에 가로로 배치. 단계 온도 PID 컨트롤러와 물의 Peltier 요소, 또는 주변 환경에 따라 노점 온도 가까이 유지를 통해 긴밀 하 게 제어 됩니다. DP 단계 (7)는 microcapillary 기준으로 그리드를 이동 하는 전동된 xy 축에 거치 된다. 자체 microcapillary z 단에 탑재 되 고 그것은 매우는 그들 격자의 표면 가까이 낮 췄 다 고 수 (연속 얇은 탄소 층 NS-EM 또는 cr에 대 한 홀리 탄소 필름을 덮고 샘플 지원에 nanoliter 크기의 볼륨을 분배 하는 데 사용 요-EM)입니다. Note 액체 흡수와 분배 정밀 펌프 시스템 (8)를 사용 하 여 수행 됩니다. 분사 액체는 나선형 패턴에는 microcapillary 기준으로 그리드를 이동 하 여 배포할 수 있습니다. 곳을 알아내는-EM 준비에 대 한 선택 식이 얼어 메커니즘 (9) 빠르게 샘플 로드 그리드 샘플 vitrification 급속 한 냉각 한 액체 탄 (10)으로 전송합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 은 NS EM 격자 cryoWriter 설정을 사용 하 여 준비에 대 한 대표적인 결과 보여준다. microcapillary의 팁 5 로드 NS와 소금 이온의 퍼지는 교환 수 있도록 재고 솔루션에서 샘플 및 몇 분 동안 NS 솔루션 (2% methylamine tungstate)의 저수지로 감소의 nL (이론적인 토론 참조 아놀드, 외 그 외 여러분 24). 나중에, 조건된 샘플 NS EM 격자의 얇은 탄소 필름에 적절 하 게 되었고 건조. 그림 3 A 양적 가장에 필요한 완전 한 방울을 시각화 하기 위해 같은 방법으로 슬롯 격자의 사용을 보여줍니다. 커피 고리 효과 피하려면 갓 글로우 방전 그리드-노점 온도 (물 증발)에서 처음 개최 되었고 천천히 데워 DP-무대에. Note는 대부분의 응용 프로그램 (예를 들어, 샘플 또는 구조 분석의 품질 관리)에 대 한 느린 건조 과정이 필요 하지 않습니다. 높은-품질 NS- 그림 3B, C와같이 준비 없이, 얻을 수 있습니다. 컨디셔닝 시간 낮은 인산 염-무료 소금 버퍼는 약 3 분, 예를 들어, 낮은 소금 Tris 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4 50 m m NaCl), 담배 모자이크 바이러스 (TMV)를 사용 하 여 그림 3B 와 같이 샘플으로. 그림 3 C 는 TMV PBS 버퍼 (2.7 m m KCl, 1.5 m m KH2포4, 136.9 m m NaCl, 8.9 mM 나2HPO4·7H2O, pH 7.4)에 최악의 시나리오를 제공 합니다. 인산 염 이온 NS ( 그림 5C참조)의 중 금속 이온을 길게 하는 컨디셔닝 시간 (7 분) 과도 결정을 형성 한다. 다른 중 금속 소금 격자 준비 모듈, 예를 들면, 2 %methylamine 바 또는 황화 몰 리브 덴도 사용할 수 있습니다 (참고 아놀드, 외. 그러나 24)., uranyl 아세테이트는 적합 한; 이 얼룩의 가교 효과 리드 집계 경우 탄소에 흡착 (참조 그림 5E)23영화 전에 단백질 샘플 솔루션에서 조절 된다. 그림 3: 그림 1C에서 cryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 NS 격자에 대 한 일반적인 결과. A) 2% methylamine tungstate와 컨디셔닝 후 슬롯 격자에 적절 하 게 3 nL 물방울의 개요 이미지. B) TMV 20 mM TRIS 버퍼에. 삽입 표시 된 영역의 3 배 확대를 보여줍니다. 아놀드, 외.24 에서 적응 (발췌 자료에 관련 된 추가 권한을 ACS에 직접 해야 합니다). C) PBS 버퍼에서 담배 모자이크 바이러스 (TMV). 삽입 표시 된 영역의 3 배 확대를 보여줍니다. 아놀드, 외.24 에서 적응 (발췌 자료에 관련 된 추가 권한을 ACS에 직접 해야 합니다). 스케일 바: A, 100 µ m; B, 50 nm; C, 80 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. CryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 곳을 알아내는-EM 격자에 대 한 일반적인 결과 그림 4에 묘사 된다. 패널 4A 그리드 아틀라스를 vitrified 샘플 영역을 보여 줍니다. 패널 4B 선택한 그리드 슬롯에 유리 같은 얼음의 동질성을 보여준다. 두 경우 모두, 샘플 25mm HEPES 코 pH 7.5, 50 m m NaCl 버퍼 0.05% 포 14 세제를 포함 했다. 많은 샘플 및 버퍼 테스트와 유사한 고품질 유리 얼음 얻은, 하지만 필요 조건은 종속 버퍼 ( 그림 5의 내용 참조). 패널 4 C 증가 대비 높은 defocus에서 몇 군데 Tris HCl 버퍼 (20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4)에 apoferritin 입자와는 살 균 소를 보여줍니다. 패널 4 D amphipoles에 의해 안정 200 kDa 막 단백질을 보여줍니다. 그림 4: 그림 1D에 표시 된 대로 cryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 곳을 알아내는-EM 격자에 대 한 일반적인 결과. 샘플 및 버퍼 표시 하는 예제에서 다. 모든 샘플은 홀리 탄소 필름에 로드 되었습니다. A) 150 kDa 막 단백질, 유리 같은 얼음의 주변을 포함 하는 샘플의 개요 이미지 (“그리드 아틀라스”)의 콜라주 흰색 화살표로 표시 됩니다. B) 유리 얼음 홀리 탄소 필름을 보여주는 동일한 버퍼 준비 그리드에서 확장 그리드 슬롯. 어떤 구멍은 하지 흰색 화살표에 표시 된 대로 샘플 버퍼를 채워진다. C) 탄소 구멍 vitrified 샘플 포함 하는 apoferritin 단백질 복합물 및 살 균 소. 삽입: 두 가지 확대는 살 균 소의 꼬리를 보여주는. 흰색 별표가 나타냅니다 탄소 필름. 참고 이미지 대비를 증가 높은 defocus 함께 기록 되었다. D) amphipols에서 재구성 한 200 kDa 막 단백질. 삽입: 증가 대비 표시 표시 된 영역의 2 배 확대. 스케일 바: A, 100 µ m; B, 10 µ m; C와 D, 80 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. CryoWriter 설치 허용 체계적인 최적의 EM-그리드 준비 조건;에 대 한 심사 예를 들어 그림 5A 에 표시 됩니다 (25mm HEPES 코 pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05%에서에서 apoferritin 포 14). 이 실험에서 “대머리” 온도 유리 얼음 다양 했다, 하지만 (즉, 샘플 응용 프로그램 및 식이 어 간의 시간 간격) 숱이 시간 상수 (1 s). 낮은 오프셋된 온도에서 (예를 들어, 8 K), 샘플 레이어 너무 두꺼운 했다. 오프셋된 고온에서 구멍에 유리 얼음이 얇은 (10k, 12k) 될 때까지 (위 18 K) 어떤 단계에서 격자 완전히 건조 (표시 되지). 결과에서 제시 여기, 유리 같은 얼음의 큰 균질 지역 12 K의 오프셋 검은 화살표에 표시 된 대로. “테스트” 단백질 (예: apoferritin)를 사용 하 여 대상 샘플의 버퍼와 같은 최적화 실험을 수행할 수 있습니다. 발견 최고의 조건 대상 샘플에 적용 됩니다. 또한, 최적의 멀리 매개 변수와 함께 격자 준비 절차 동안 자주 인식 될 수 있다 하 고 상당한 시간을 절약 하는 전자 현미경에서 상영 될 필요가 없습니다. 그림 5 또한 일반적인 곳을 알아내는-EM (패널 B) 및 NS-EM (e 패널 C) 유물 갤러리 cryoWriter 설치에 보여줍니다. 0.1 cyl-β-D-maltopyranoside (2.7 m m KCl, 1.5 m m KH2포4, 136.9 m m NaCl, 8.9 m m 나2HPO4·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM)를 포함 하는 PBS에 TMV와 패널 5B에 표시 된 곳을 알아내는-EM 그리드 thinned 지나치게 되었다. 너무 높은 소금 농도 때문에 이미지의 배경 낟 알입니다. 일반적으로 샘플의 시각적 모양을 하지 않는 소금 농도;의 선형 함수 곡물은 갑자기 눈에 띄는 임계값 농도 숱이 과정에 도달 하면 된다. NS-그들에 대 한 프로토콜 섹션 1.6에서에서 설명한 대로 그리드 준비 전에 컨디셔닝 단계에 의해 원치 않는 물질을 제거할 수 있습니다 note. NS는 다른 아티팩트를 발생할 수 있습니다. 패널 5 C의 예에서는 PBS 버퍼 (2.7 m m KCl, 1.5 m m KH2포4, 136.9 m m NaCl, 8.9 mM 나2HPO4·7H2O, pH 7.4) 샘플 없이 3 분 침전 물에 대 한 2% methylamine tungstate에 조절 되었다에 결정 분명 균열에 지도 하는 탄소 표면에 광범위 한 힘을 발휘 하는 고. 침전 유일한 형태로 특정 PBS 및 NS 농도 범위 및 더 이상 ( 그림 3C비교)에 대 한 샘플을 조절 함으로써 피할 수 있습니다. 패널 5 분사 NS 샘플 드롭릿 “커피 링” 전시의 주변을 보여줍니다. 이 양적, 총 샘플 분석을 방해 하 고 샘플 응용 프로그램, 동안 이슬점 온도에 EM 격자를 유지 하 고 (건조 온도 점차적으로 증가 함으로써 즉, 건조 과정을 늦추고 하 여 피할 수 있습니다. 그림 3A참조). 패널 5E (20 mM HEPES, pH 7.0, 조건된 3 분 apoferritin) 그들은 탄소 필름 지원에 흡착은 전에 조건 단백질 견본을 사용할 수 없는 2 %uranyl 아세테이트 얼룩의 가교 활동을 보여. 그림 5: 체계적인 변경 및 유물 관찰 때 cryoWriter 설정 준비 격자에 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM을 사용 되었다. A) 체계적인 유리 얼음 두께 변화; 곳을 알아내는-그들에 대 한 그리드 준비의 최적화입니다. DP 단계의 오프셋된 온도 다양 한 (8 K 12 K) 유지 숱이 시간 상수 (1 s). 화살표 샘플 계층의 주변을 나타냅니다. B) 소금 효과; 너무 높은 집중, 즉, 숱이 단계 너무 길었다. 삽입 표시 영역의 2 배 확대를 묘사 한다. C) 침전 PBS 버퍼 중 금속 소금의 존재에 의해 형성 된 소금. 샘플 PBS 버퍼를 포함 하는 다른 버퍼에 샘플 보다 더 이상 조절 해야 합니다. 여기, PBS 버퍼 샘플 없이 다른 샘플 버퍼에 대 한 일반적인 시간 3 분, 2% methylamine tungstate에 조절 했다. 탄소 필름 아마 가장 얇은 지원에 행동 하는 건조 과정에서 침전에서 강한 힘 때문에 균열 note D) ‘커피 고리’ 효과. E) Apoferritin 3 분 Uranyl 이온 전시 중요 한 가교 활동과 apoferritin에 대 한 2 %uranyl 아세테이트 단련 클러스터 양식 큰 집계. 스케일 바: A, 80 µ m; B, 80 nm C 12 µ m; D, 80 µ m; E, 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 작은 금액 및 볼륨 cryoWriter 설정을 사용 하 여 EM 그리드 준비에 필요한 새로운 유형의 실험을 수 있습니다. 예를 들어 단일 셀의 전체 내용은 수집 하 고 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM 준비 될 수 있습니다. 프로시저는 그림 6A에 표시 됩니다. 부착, 진 핵 세포 (HEK 293)은 동시 electroporation 및 샘플 포부 (패널 6A)25lysed. 3의 총 볼륨 nL은 발음, lysate, 셀이 들어 및 추가 처리를 위해 microcapillary에 유지 됩니다. NS-EM 패널 6B에 나와, 대 한 세포 배양 매체는 세포 세포의 용 해 이전 PBS 버퍼 (2.7 m m KCl, 1.5 m m KH2포4, 136.9 m NaCl, 8.9 mM 나2HPO4·7H2O, pH 7.4 m) 교환 했다. 셀 내용 3에 발음 했다 버퍼의 nL과 같이 그림 1C 에서 10 분에 대 한 나중 NS의 저수지에서 단련, 5 nL 볼륨 NS EM 격자의 지속적인 탄소 필름에 적절 하 게 되었다. 개별 단백질, 예를 들면, filamentous 말라와 연결 된 단백질 막 패치 이미지에서 인식 될 수 있습니다. 그림6 C에 표시 된 곳을 알아내는 EM에 대 한 3의 볼륨 nL은 적절 하 게에서 액체를 제거 하기 위하여 다시 포부 없이 홀리 탄소 EM 그리드. 형성 하는 샘플의 비교적 두꺼운 필름 vitrification 전에 thinned 광범위 하 게 했다. 이렇게 하려면 DP 단계 온도 점차 증가 되었다,-노점 온도에서 시작. 미리 지정 된 임계값 ‘ 선택 및 식이 ‘ 메커니즘 (자세한 내용은 참조 아놀드, 외. 샘플 vitrification 트리거링에 도달 했다 때까지 숱이 과정 실시간 센서 시스템에 의해 감시 했다 26). 막 구조와 단백질 이미지에서 인식 될 수 있다. 그림 6: 단일 셀 시각적 proteomics cryoWriter 설정을 사용 하 여. A) 단일 부착 진 핵 세포의 세포의 용 해. 셀에는 기능성된, ITO 코팅 (레드) 유리-슬라이드 (2) 소형된 페 트리 접시 (3)25(1, 녹색)를 성장 이다. 이토 계층 전기 기초 하 고 있습니다. 셀 microcapillary (4), 백 금 코팅 되어 있는 접근 이다. (나타나지) 초기 삼투성 충격을 전기 펄스에 의해 수행은 세포 lysate의 열망 하는 동안가 해지는 전단 세력에 의해 세포의 용 해를 촉진 하기 위하여 주어진 다. 가벼운 현미경 검사 법;에 의해 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 현미경의 대물 렌즈 표시 (5)입니다. 자세한 내용은 우리의 이전 작품24,25를 참조 하십시오. B) 에서 개별 HEK 293 세포 lysate의 NS-EM 이미지. 연결 된 단백질 filamentous 말라와 막 패치를 볼 수 있습니다. 아놀드, 외.24 에서 적응 패널 (발췌 자료에 관련 된 추가 권한을 ACS에 직접 해야 합니다). C) 에서 개별 HEK 293 세포 lysate의 Cryo-EM 이미지. 삽입 된 전형적인 막 관련 단백질 구조 표시 됩니다 표시 된 영역의 2 배 확대를 보여줍니다. 패널 C 스케일 바 아놀드, 외. 26 에서 적응: B, 50 nm; C, 80 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

‘CryoWriter’ 악기와 샘플 격자에 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM 크기 nL 총 샘플 볼륨에서 준비 하 고 고전적인 종이 blotting 단계를 완전히 방지 하는 데 필요한 프로토콜도 제공 됩니다. 미세 원칙과 micromechanical 시스템은 이것을 가능 하 게 cryoWriter에 결합 됩니다.

우리의 경험을 보여줍니다이 원고에 소형된 메서드를 사용 하면 EM-그리드 준비에 대 한 매개 변수 공간 고아 한 방법, 그리고 엄격한 사용자 통제 보다 큰. 중요 한 것은, 달성 증가 재현성 샘플 버퍼 시스템, 실제 실험을 수행 하기 전에 최적의 매개 변수를 확인 하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 테스트 단백질 보충 사전 검열 수 있습니다. 이 최소는 절대 관심의 샘플의 소비를 유지 하 고는 것이 좋습니다. 두 NS 및 곳을 알아내는 EM 그리드 준비에 대 한 중요 한 단계는: (i) 못쓰게 펌프 시스템; 하위 nanoliter 볼륨 분배, 시스템의 액체 (물) 고 해야 합니다 degassed 무료 거품. (글로우 방전의 플라즈마 청소 단계; ii) 정밀 하 게 제어 그들 격자의 표면 특성은 재현성 결과 위해 중요 한. (iii) 샘플 컨디셔닝; 컨디셔닝, 예를 들어, NS와 필요한 시간은 microcapillary²⁴의 노즐 형상에 뿐만 아니라 버퍼 유형, 소금 콘텐츠 및 농도 (그림 3)에 따라 달라 집니다. (4) 증발 속도 NS EM 양적 EM;에 대 한 준비에 대 한 커피 고리 효과 NS 그들 준비의 정량 분석을 금지 수 있습니다 그리고 느린 증발 속도 DP-단계에 의해 제어에 의해 억압 해야 합니다.

제시 그리드 준비 방법의 다른 측면은 특정 샘플에 대 한 다양 한 프로토콜의 개발을 수 있도록 자유롭게 결합 수 있습니다. 전형적인 예는 cryo-EM;에 대 한 그리드 준비 전에 컨디셔닝 단계 고해상도 그들, 예를 들어, 글리세롤, 방지 하는 물질의 제거 될 것 이라고 ligands는 격자 준비가; 전에 컨디셔닝에 의해와 같은 중재자 분자의 도입 또는 단일 세포 lysate 여 NS 또는 곳을 알아내는-EM (그림 6)의 검사.

마이크로 및 제시 방법에 최소한의 샘플 금액을 사용 하 여 완전히 종이 blotting 단계에 대 한 필요성을 제거합니다. 이것은 큰 장점은 종이 럽은 단백질, 잠재적으로 원치 않는 이온 샘플 오염 및 본질적으로 이어지는 대규모 샘플 손실에 대 한 가혹한 치료 때문. 다른 한편으로, 잠재적으로 형성 하는 곳을 알아내는-EM 샘플 고전적인 방식으로 준비가 때 얇은 샘플 영화의 공기-물 인터페이스에 의해 발생 하는 효과 cryoWriter 사용 하는 경우를 방지 하지 됩니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 적합 한 격자는 샘플 응용 프로그램 및 vitrification (데이터 표시 되지 않음) 사이의 미만 0.2 s 대기 시간으로 준비 수 있습니다. 그러나, 단백질 보급에 의해 몇 나노초에 나노미터의 몇 가지 tenths 여행, 아직 충분 한 시간이 있다 100 nm 두꺼운 샘플 영화의 공기-물 인터페이스와 여러 번 충돌 하. 그러나, 공기-물 인터페이스에 집착 하는 단백질의이 짧은 시간 간격으로 크게 줄어들 수 있습니다 및 단백질 변성을 방지 수 있습니다 또는 입자 방향 제한. 공기-물 인터페이스에서 중요 한 단백질을 보호할 수 있습니다 또 다른 유망한 방법은 낮은 분자량 표면 활성 물질에 의해 샘플 영화를 커버입니다. 이러한 화합물 그리드 준비 하기 전에 cryoWriter에서 컨디셔닝 단계 빠르게 도입 될 수 있습니다. 미세 시스템의 높은 표면 볼륨 비율 샘플 microcapillary 표면에 난다 흡착에 의해 잠재적으로 손실 될 수 및 입자를 계산 하 여 정량 분석을 방해로 cryoWriter의 더 한계입니다. 문제는 두 가지 방법으로 해결: 먼저, 샘플은 microcapillary 내에서 긴 거리를 여행 하지 않습니다. 실제로, nanoliter 샘플 볼륨 처리를 통해 모 세관 끝에 남아 있습니다. 둘째, 셋째 비교적 큰 내부 직경, 예를 들어, 180 µ m.와 microcapillaries을 사용 하 여 볼륨 비율을 감소 추가,는 microcapillaries의 표면 필요한 경우 쉽게 패 수 있습니다 예를 들어, 그들을 치료 하 여 상업적으로 사용 가능한 polylysine 에탄올 glycols (PLL-PEG)와 함께

EM에 사용 되는 단일 입자 접근 방식에 의해 단백질의 고해상도 분석에는 개별 단백질 입자의 몇 백만 이미지 100000을 필요 합니다. 즉, 미세 기술 구조 조사에 대 한 충분 한 단백질 복합물을 제공할 수 있습니다. 단백질 복합물 (약 1 시간) 최소 셀 금액 (약 40, 000 셀)에서 빠른 격리에 대 한 소형된 면역-강수량 메서드 이전²⁸개발 되었다. 이 메서드는 cryoWriter의 소형된 샘플 준비 단계에 직접 연결 됩니다 이제. 최종 목표는 모든 미만 2 시간을 요구 하는 빠른 단백질 분리 및 곳을 알아내는-EM 그리드 준비에 대 한 통합 된 미세 파이프라인을 개발 하는 것입니다. 또한, 그림 6, 분 양과 샘플 준비와 거의 무손실 컨디셔닝 및 그리드 준비 절차는 cryoWriter를 사용 하 여 달성에 필요한 자료의 볼륨에 의해 증명으로 가능 하 게 단백질 연구 개별 셀 단지 함께, 소형된 면역-강수량 메서드와 cryoWriter 같이 우리가 최근 열 충격 실험²⁴“단일 셀 시각적 proteomics” 라는 새로운 단백질 방법의 기초를 하다. 데이터 분석 알고리즘 “비주얼 proteomics” 이미지의 분석에는 현재 테스트 되 고.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 그들의 지원, S. A. 뮐러 중요 한 토론 및 신중 하 게 읽고 원고, A. Fecteau-LeFebvre EM, 리카 르도 Adaixo, 프랭크와 기술 지원에 대 한 바젤 대학의 Biozentrum의 워크샵을 감사 하 고 싶습니다. 레만 막 단백질에 대 한 테스트 샘플 (C-중국, Biozentrum, 바젤의 대학에서 모두)와 A. 엥 겔, 그의 영감 대화에 대 한 명예 대학 바젤. 테스트 샘플 P. Ringler, M. A. 제공한 친절 하 게 Mahi, T. Schwede (Biozentrum, 바젤의 대학), P. Leiman (구조 생물학 및 생물 물리학, EPFL의 실험실) 및 R. 디아즈-아 (뉴욕 구조상 생물학 센터, 미국). 프로젝트는 스위스 Nanoscience 연구소 (SNI, 프로젝트 P1401, ARGOVIA 프로젝트 MiPIS)와 스위스 국립 과학 재단 (SNF, 프로젝트 200021_162521)에 의해 지원 되었다.

Materials

Liquid handling
Microcapillary tip	New Objective	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve	New Objective	CONGAS-1	Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25
Syringe 10 µl	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included)
Syringe pump controller	Cetoni	A3921000093	neMESYS controller
Syringe pump dosing unit	Cetoni	A3921000095	neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor	Meltec	UFT75-AT	Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller	Cooltronic	TC2812	PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40×40 mm
Water-cooling block	–	–	Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base
Water pump	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block	–	–	Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis	Dyneos AG	M-404.2PD	High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage	Prior Scientific	H117EIL5	Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets	Supermagnete	S-05-08-N	Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Electromagnet control PCB board
Solenoid hub	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers	Electron Microscopy Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts	Thorlabs	–	–
Various mechanical parts	Workshop Biozentrum, University Basel	–	Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM	emsdiasum.com	DTF-03523	30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537 SIGMA	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negative stain vanadium based
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negative stain tungsten based
Software
openBEB			The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin)			Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

References

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Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).