Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Claudio Schmidli; Luca Rima; Stefan A. Arnold; Thomas Stohler; Anastasia Syntychaki; Andrej Bieri; Stefan Albiez; Kenneth N. Goldie; Mohamed Chami; Henning Stahlberg; Thomas Braun

doi:10.3791/57310

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생물학

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Published: July 27, 2018

doi:

10.3791/57310

Claudio Schmidli*^1,2, Luca Rima*¹, Stefan A. Arnold*^1,2, Thomas Stohler¹, Anastasia Syntychaki¹, Andrej Bieri¹, Stefan Albiez¹, Kenneth N. Goldie¹, Mohamed Chami³, Henning Stahlberg¹, Thomas Braun¹

¹Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum,University of Basel, ²Swiss Nanoscience Institute,University of Basel, ³BioEM lab, Biozentrum,University of Basel

Summary

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Abstract

Als gevolg van de recente technologische vooruitgang, wordt cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) snel steeds een standaardmethode voor de structurele analyse van eiwitcomplexen atomaire resolutie. Eiwit isolatie technieken en monster bereidingswijzen voor EM blijven echter een knelpunt. Een relatief klein aantal (100.000 tot een paar miljoen) individuele eiwit deeltjes moet worden beeld voor de hoge-resolutie analyse van eiwitten door het één deeltje EM aanpak, waardoor verkleinde monster behandeling technieken en beginselen van de microfluidic haalbaar.

Een verkleinde, bevlekken-papierloze EM raster voorbereiding methode voor monster pre-conditionering, EM raster priming en nabewerking die alleen nanoliter volumes van monster verbruikt wordt gepresenteerd. De methode maakt gebruik van een doseersysteem met een sub-nanoliter precisie van vloeibare opname van de controle en EM raster priming, een platform waarmee de temperatuur van de raster waardoor het bepalen van de relatieve vochtigheid boven het EM-raster en een pick-en-duik-mechanisme voor het monster verglazing. Voor cryo-EM, een raster van EM in het werkgebied temperatuurgevoelig is geplaatst en het monster wordt in een capillair aanzuiging. De capillaire tip is geplaatst in de nabijheid van het oppervlak van het raster en het raster is geladen met het monster overmaat is opnieuw opgezogen in de microcapillary. Vervolgens is het monster film gestabiliseerd en lichtjes dunner door verdamping van de gecontroleerde water geregeld door de verschuiving van de platform-temperatuur ten opzichte van het dauwpunt. Op een gegeven moment wordt het mechanisme van de pick-en-duik geactiveerd, snel overbrengen van de primer EM raster naar vloeibaar ethaan voor monster verglazing. Als alternatief, monster-conditioning methoden zijn beschikbaar voor te bereiden op monster nanoliter middelgrote volumes negatieve vlek (NS) EM.

De methoden sterk monster verbruik te verminderen en voorkomen van benaderingen van potentieel schadelijke eiwitten, zoals het filtreerpapier bevlekken gebruikt in de conventionele methoden. Voorts staat de minuscule hoeveelheid monster nodig nieuwe experimentele strategieën, zoals snelle monster conditioning, combinatie met eencellige lysis voor “visuele proteomics”, of “lossless” voorbereiding van de totale steekproef voor kwantitatieve analyse van complexe monsters.

Introduction

Hardware en software voor de structurele analyse van eiwitcomplexen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) heeft massaal op vooruit gegaan gedurende de afgelopen jaren. De verbeteringen die zijn aangebracht aan een “resolutie revolutie”¹^,² geëffend en fundamenteel veranderd structurele onderzoek. De revolutie begon met de komst van cryo-Elektron microscopie (cryo-EM)³^,⁴, zodat de voorbereiding van biologische monsters onder dichtbij fysiologische omstandigheden terwijl het verminderen van de gevoeligheid van de straling en het voorkomen van de verdamping van het monster in de hoog vacuüm van de transmissie elektronenmicroscoop⁵. In de daaropvolgende jaren verhoogde incrementele technologische vooruitgang geleidelijk de resolutie haalbaar. Onder deze innovaties waren de toepassing van veld-emissie kanonnen⁶^,⁷, en, meer recentelijk, verbeterd data analyse algoritmen, zoals maximale waarschijnlijkheid methoden⁸^,⁹. Directe elektron detector camera’s¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, filmwijze beeldvorming en de bijbehorende software ontwikkelingen¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶ ^, ¹⁷, verstrekt de definitieve doorbraak verplicht te bereiken van atomaire resolutie voor biologische monsters door één deeltje analyse (Zie voor een overzicht Cheng, Grigorieff, et al.. ¹⁸). het belang van cryo-EM werd onlangs erkend door de toekenning van de Nobelprijs voor de Scheikunde tot drie van de Pioniers.

Naar een biologische steekproef door TEM image, de methode gebruikt voor het laden van het EM-raster met monster (hierna “raster voorbereiding” genoemd) moet ervoor zorgen dat de resulterende monster laag (i) dun genoeg (< 100 nm) te vermijden veelomvattend rumoer door inelastisch of vermenigvuldigen verspreid elektronen, (ii) het hoog vacuüm van de elektronenmicroscoop doorstaat, en (iii) de biomoleculen beschermt tegen schade door straling. Twee belangrijkste methoden worden gebruikt om te voldoen aan deze voordelen: negatieve vlek(NS)¹⁹^,²⁰ procedures (Figuur 1A) adsorberen van het monster, tot een dunne koolstof-film, de biomoleculen insluiten in amorfe heavy metal en vervolgens toestaan dat de vergadering te drogen in de lucht. Dit is eenvoudig en snel, en de geladen EM rasters (hierna “monster rasters” genoemd) zijn gemakkelijk te slaan en kan worden gehouden voor langere tijd (meestal jaren). In TEM, de voorbereidingen vertonen hoog contrast als gevolg van de NS en tolereren van hogere doseringen van de elektron dan cryo-voorbereiding, maar de resolutie is beperkt tot ongeveer 20 Å. Cryo-EM procedures (Figuur 1B) dienst een koolstof ondersteunt. Een dunne film van de monsteroplossing is spanned over de gaten en het EM-raster is ondergedompeld in een cryogen, meestal vloeibaar ethaan, te snel afkoelen onder-150 ° C. Het resultaat is een amorf, verglaasd, 50 tot 100 nm-dikke film van de oplossing in de gaten van de steun. Deze dunne, amorf film doorstaat de hoog vacuüm in de elektronenmicroscoop en, in het ideale geval behoudt biologische structuren in hun oorspronkelijke staat. De procedure kan biologische monsters aan het image worden gemaakt op hoge resolutie. Echter moet het raster van steekproef worden bewaard bij temperaturen hieronder-150 ° C te allen tijde te vermijden ontglazing. Image kan worden gemaakt met behulp van relatief hoge elektron doses als gevolg van de lage temperatuur, maar het contrast en signaal-/ ruisverhouding is toch laag. Dus gemiddeld technieken zijn gebruikt om het contrast te verhogen en, mits de steekproef is beeld vanuit verschillende hoeken, een high-resolution driedimensionale (3D)-kaart kan worden gereconstrueerd. De meest gebruikte en zeer succesvolle methode voor 3D reconstructie vanaf nu is de aanpak van één deeltje. Zie voor een recente review, Cheng op al.¹⁸.

Negatieve vlek TEM (NS-EM) is belangrijk voor screening en kwaliteitscontrole, wanneer hoog contrast vereist is of wanneer er slechts een beperkte hoeveelheid monster beschikbaar zijn (adsorptie aan de koolstof-film over het algemeen richt zich het monster). Één deeltje cryo-EM is de gouden standaard methode als high-resolution 3D-reconstructies van de eiwitstructuur voor zijn gericht.

Figuur 1: beginselen van TEM raster voorbereiding en vergelijking tussen het klassieke (deelvenster A, B) en een microfluidic benadering (deelvenster C, D). A) klassieke NS-EM raster voorbereiding: over 3 µL van monster zijn afgepipetteerde met de hand op een raster van de EM bedekt met een film van de continue koolstof (hierna een “NS-EM raster’ genoemd) (i). Na incubatie gedurende ca. 10 s, filterpapier wordt gebruikt om de vlek weg de overtollige vloeistof uit de kant (ii), waardoor de geadsorbeerde biomoleculen in een dunne water-film. Het eiwit is vervolgens geïncubeerd in een zoutoplossing van heavy metal, bijvoorbeeld, 2% uranyl acetaat, voor 20 s (iii), en opnieuw de vloeistof wordt verwijderd door het bevlekken van de kant met behulp van filtreerpapier (iv). Tot slot wordt het EM-raster overgelaten aan het drogen in de lucht. B) klassieke cryo-EM raster voorbereiding: afgepipetteerde over 3 µL van monster zijn door een hand op een film van een koolstof. Vormen een dunne monster film, wordt de overtollige vloeistof verwijderd door papier-bevlekken gezicht-op uit één of beide zijden (ii). Tot slot is het raster snel ondergedompeld in vloeibare ethaan voor verglazing (iii). C) NS-EM raster voorbereiding met behulp van het cryoWriter-setup: A 5 nL volume is aanzuiging uit de voorraad van de monster met behulp van een microcapillary (i). De microcapillary tip is voor monster conditioning, ondergedompeld in de conditionering oplossing, bijvoorbeeld2% ammoniumacetaat. Ionen en kleine moleculen worden uitgewisseld door diffusie (ii). Merk op dat de afmetingen van de microcapillary ervoor zorgen dat het hele proces diffusie gedreven. Eiwitten hebben veel lagere diffusie-constanten zijn dan zout ionen en²⁴niet aanzienlijk verloren. Tot slot is het monster afgeleverd op de grid en toegestaan om te drogen (iii). D) beginselen van cryo-EM raster preparaat met behulp van de cryoWriter gebaseerde methode: An EM raster bedekt met een film van een koolstof is geplaatst op het oppervlak van een temperatuurgevoelig platform en gehouden door pincet. De temperatuur van het platform wordt beheerd op een offset van de dauwpunt temperatuur van de omgeving van het raster. Het raster wordt verplaatst ten opzichte van de microcapillary met het monster en de microcapillary wordt verlaagd totdat het enkele micrometers boven het raster. Vervolgens zijn een paar nanoliters van monster afgezien van het terwijl de fase wordt verplaatst in een spiraalpatroon; overtollige vocht is opnieuw aanzuiging (i). Na EM raster priming, de microcapillary is ingetrokken en het raster blijft op de temperatuur gecontroleerde platform (hierna genoemd als dauwpunt (DP) fase) voor een korte tijd om een gecontroleerde hoeveelheid monster te verdampen. Voor duik bevriezing, is het raster snel teruggetrokken uit het werkgebied met het pincet (ii), bladerde door 90° in de verticale positie, en ondergedompeld in een bad met cryogen (iii) (hierna ‘pick-en-wagen’ mechanisme genoemd). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Helaas, het raster voorbereiding methoden voor NS en cryo-EM hebben niet aanzienlijk verbeterd sinds ze werden uitgevonden. Huidige nadelen zijn de hoge monster consumptie (ca. 3 µL van het eiwit van 1 mg/mL) en de grote hoeveelheid (> 99%) monster verloren (Figuur 1A, B). Bovendien, de klassieke methode gebruikt voor te bereiden op rasters cryo-EM is een strenge procedure voor eiwitten: ten eerste, het gaat om een uitgebreide gezicht-op papier-bevlekken stap (Figuur 1B, ii), en ten tweede, het eiwit wordt blootgesteld aan de lucht-water-interface voor een aanzienlijke hoeveelheid tijd²¹. Hier, een alternatieve methode voor het monster preconditionering, Raster monstervoorbereiding en post-processing (raster drogen of verglazing) voor NS-EM (Figuur 1C) of cryo-EM (Figuur 1D) wordt gepresenteerd. De in-house gebouwde setup, genaamd “cryoWriter”, gebruikt verkleinde monster hanteren beginselen van technologie- en microfluidic gecombineerd, voorwaarde en afzien van monster, vermijden papier volledig bevlekken en het bieden van alternatieve methoden voor dunne monsters voor Cryo-EM. Het aanzienlijk vermindert monster consumptie en verbetert gebruiker-controle over de bereiding van de monsters als geheel. Bovendien, de methode maakt het mogelijk nieuwe experimentele toepassingen; zoals de voorbereiding van geïsoleerde biologische componenten van afzonderlijke cellen in een aanpak genaamd “eencellige visuele proteomics”²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

Protocol

Een “cryoWriter” (Figuur 2; voor details zie vorige werk24,-26,27) of gelijkwaardige instrumentatie is vereist voor de volgende protocollen. Een lijst van leveranciers voor de belangrijkste onderdelen en verbruiksartikelen wordt gegeven in de Tabel van materialen. 1. negatieve vlek (NS) raster voorbereiding Het instrument inschakelen en opstarten van de software. Initialiseer alle nodige modules (spuit pomp controller, gemotoriseerde stadia, bewakingscamera’s en dauwpunt fase). Koel de steun van de steekproef en het dauwpunt stadium. Indien nodig, zorg ervoor dat de temperatuur van het dauwpunt fase wordt geregeld 1-2 ° C boven het dauwpunt.Opmerking: De fase wordt afgekoeld door een commerciële Peltier apparaat met een PID-regelaar. NS voor te bereiden door het invullen van een 100 of 200 µL PCR buis met 100-150 µL van NS (b.v., verkrijgbare 2% methylamine wolframaat). Plaats de buis op de steun van de gekoelde monster van het instrument. Positie het monster. Zet het monster (0.5 – 1 µM) in een 100 of 200 µL PCR buis. Als minder dan 50 µL van monster beschikbaar is, afgesneden van de onderkant van de buis van een PCR met een scheermesje en gebruik het als een monster goed. Dit zal ervoor zorgen dat de microcapillary het monster gemakkelijk kunt bereiken.Opmerking: Het is het makkelijkst te gecombineerd monsters van 100 of 200 µL PCR buizen, omdat de microcapillary later gebruikt om het monster gecombineerd iets bewogen wordt en de richting van de z-as reizen-hoogte beperkt is. Plaats de PCR buis/container op de steun van de gekoelde monster in het instrument ter voorkoming van verdamping. U kunt ook kunnen monsters worden aanzuiging van goed platen in de Microscoop fase top incubator bij kamertemperatuur; koeling is niet geïmplementeerd voor goed platen. Posities definiëren. Gebruik de joystick van de cryoWriter die de gemotoriseerde xy-fase en de bedieningsknoppen van de software voor de lineaire x-, y- en z-as fasen van de positie van de microcapillary regelt. Gebruik de camera om te controleren de positie van het capillair. Verplaats de microcapillary naar het reservoir van de steekproef. Dompel de tip in de steekproef vloeistof en opslaan van deze positie als de “monster”. Verplaats de microcapillary naar de NS PCR-buis, de tip onderdompelen in de NS-oplossing en opslaan van deze positie als “vlek”. Plaats de microcapillary ongeveer 100 µm boven het midden van de sleuf waar de EM-raster wordt geplaatst en opslaan van deze positie als “grid_save”. Monster gecombineerd en conditie het voor NS-EM. Indien nog niet geïnstalleerd, zet u een 10-µL spuit (0.46 mm binnendiameter) op een precisie-spuitpomp. Lijm het ene uiteinde van een 30 cm lange gesmolten siliciumdioxide microcapillary (buitendiameter 360 µm, inwendige diameter 150 µm) aan op de wandcontactdoos van de spuit. Sluit het andere einde van de microcapillary naar een kort (5 cm) lang tapered microcapillary via pers passen-connector. De taps toelopende tip van de korte microcapillary vormt de verstrekking tip. Vul de injectiespuit met ontgaste tweemaal gedestilleerd water (ddH2O; systeem vloeistof) en de vorming van luchtbellen vermijden. Afzien van een paar tientallen nanoliters systeem vloeistof en eventuele druppels uit de microcapillary met een pluisvrije weefsel verwijderen. Dubbelklik op de opgeslagen monster positie. Dit plaatst de microcapillary goed in de steekproef. Terwijl het capillair in beweging is, afzien 3 x 0,5 nL systeem vloeistof net voordat de microcapillary tip is ondergedompeld in het monster om te voorkomen dat luchtbel overlappingsbreedte er (zie noot 2 hieronder). Aspirate 5 nL van monster. Dubbelklik op de opgeslagen positie van de NS. De microcapillary is de monsterrecipiënt onttrokken en automatisch verplaatst naar het reservoir van de NS. Terwijl het capillair in beweging is, handmatig afzien van 3 x 0,5 nL monster vloeistof net voordat de tip is ondergedompeld in het reservoir om ervoor te zorgen dat er geen lucht bubbels (zie noot 2 hieronder).Opmerking: belangrijk: (1) Wanneer overschakelen van aspiratie naar verstrekking modus of vice versa, er is een klein verlies in zuiger penseelstreek verschuldigd aan speling in de versnellingen van de spuitpomp. Volgens de fabrikant, het verzet van een nieuwe eenheid ligt tussen 7 en 12 µm. Voor onze spuit met de diameter van een vat van 0,46 mm vertaalt dit naar 1-2-nL. Dus kan 1-2-nL “achterwege”, voordat monster is daadwerkelijk afgeleverd. Een kleine druppel begint meestal, om af te sluiten van de microcapillary tip na de derde 0,5 nL afzien stap. (2) een luchtbel boven/onder het monster gevangen zou maken toedieningseenheden minder nauwkeurig en voorkomen dat monster conditionering door diffusie. Laat de microcapillary ondergedompeld gedurende 3-12 minuten, afhankelijk van de steekproef buffer en mondstuk geometrie.Opmerking: Hoe hoger de zout en/of fosfaat concentratie in de buffer, des te langer de tijd nodig onderdompeling. NS diffundeert (relatief snel) in de steekproef stekker terwijl buffer zouten (relatief snel) en eiwit (veel langzamer) diffuus out. Dit verlaagt de concentratie van de buffer zouten in de steekproef die hen verhinderen wanneer het raster geladen droogt kristalliseren. Verder, fosfaat neiging om vormen een neerslag in combinatie met de NS. Bereiden van een raster en stort een plek van het geconditioneerde monster. Terwijl het monster wordt geconditioneerd, neem een stukje plakband en een PDMS-blok en de bovenzijde van het PDMS schoon door het toepassen en verwijderen van het plakband om te verzekeren dat er geen stof. Zet het PDMS blok in een petrischaal.Opmerking: Nieuwe PDMS blokken zijn ontleend aan de cleanroom. Zorgvuldig pick-up een raster (bijvoorbeeldCu, 200 of 400 gaas bedekt met een film van de Parlodion/C). Zorg ervoor om alleen de rand van het raster contact met de pincet. Plaats het op het schone PDMS blok met de koolstof-film naar boven zijn gericht. Plaats het PDMS blok met het elektriciteitsnet op een gloed-kwijting luchtbox en gloed vervullen voor 20 s met 100 W vermogen bij 0.4 mbar. Het raster wordt in een gesloten petrischaaltje opslaan. Meer gloeien kwijting tijden in het algemeen leiden tot een grotere verspreiding van de gedeponeerde monstervolume op de grid. Dientengevolge, wordt de vlek-laag dunner (zwakkere vlek). 1 min voordat de onderdompeling tijd is verstreken, begrijpen de gloed-geloosd raster met de pincet cryoWriter. Zorg ervoor dat de elektromagneet is ingeschakeld; anders inschakelen in de software. De pincet op de elektromagneet monteren en de handmatige micromanipulator schroef gebruikt voor het uitlijnen van het raster plat op het dauwpunt podium, koolstof film kant naar boven. Zorg ervoor dat de temperatuur van het dauwpunt fase wordt geregeld 1-2 ° C boven het dauwpunt en het tempo van de verdamping verminderen nadat monster is geladen. Wanneer de tijd van de onderdompeling is, dubbelklik op “grid_save”. De microcapillary tip zal veilig worden geplaatst boven het oppervlak van het raster. Handmatig brengen het uiteinde van de microcapillary in contact met het raster. Til de verstuiver door 10 µm en plaats het boven het midden.Let op: Sommige monsters met detergentia hebben de neiging om omhoog langs het buitenoppervlak van de microcapillary wanneer de vloeistof wordt aangeboden als gevolg van de lagere oppervlaktespanning. Het is belangrijk om zeer dicht bij het oppervlak van de raster om te voorkomen dat dergelijke verliezen. Afzien van 5 nL van monster op het raster. Op een droge dag, wanneer snelle verdamping plaats aan het uiteinde van de microcapillary vindt, men kan ook langzaam afzien totdat het monster op het uiterste puntje, en vervolgens snel afzien 5 nL. De microcapillary trekken en laat het geconditioneerde monster drogen langzaam het dauwpunt werkgebied (DP-fase). Zodra de monster vlek is opgedroogd, het raster verwijderen en opslaan bij kamertemperatuur in een raster doos of petrischaal. Afzien van 500 nL van systeem vloeistof uit de microcapillary en deze te verwijderen met een tissue pluisvrije. Spoel het capillair 5 keer met ethanol, wasmiddel of 1 M NaOH. Dit reinigt de microcapillary zodat het kan worden gebruikt met een ander monster. 2. Cryo raster voorbereiding Ter voorbereiding van het instrument en de monster, stappen 1,1 tot 1,5 hierboven beschreven. Als de NS is niet vereist, weglaten stap 1.3 en 1.5.2. Om te wisselen van de sample buffer of het monster voor cryo-EM voorwaarde door dialyse, bijvoorbeeldom de concentratie van de buffer zouten of invoering van additieven (bijvoorbeeld, trehalose, detergenten) de gewenste buffer gebruiken in plaats van NS in stap 1.3 en 1.5.2. Vloeibaar ethaan in een standaard cryo-container voor te bereiden. Monteren van de ethaan cup, cryo vak houder en spin en vul de cryogen container aan de rand met vloeibare stikstof; meestal vereist ongeveer 200 mL. Wacht enkele minuten totdat de ethaan cup is afgekoeld en vrij van vloeibare stikstof is. Open de gasfles ethaan en langzaam laat de gasstroom in de Beker van ethaan. Laat het vullen met vloeibaar ethaan totdat de niveau 2-3 mm onder de top; Dit duurt een paar minuten en ongeveer 5 mL vloeibaar ethaan vereist. Neem een cryo-doos en plaats het in een vrije sleuf in de cryogen-container. De spin verwijderen, plaats het deksel polystyrol op bovenkant en plaats de cryogen-container op de montage in de cryoWriter. Gloed kwijting een EM raster. Neem een stukje plakband en een Polydimethylsiloxaan (PDMS) blok en reinig de bovenzijde PDMS door toepassen en verwijderen van het plakband (verwijdert stof). Zet het PDMS blok in een petrischaal. Zorgvuldig kiezen een raster uit als u het raster. Zorg ervoor om alleen de rand van het raster contact met de pincet. Plaats deze op een schone PDMS blok met de film van de gaten koolstof naar boven zijn gericht. Plaats de PDMS blokkeren met het raster in een plasma schoner en plasma-schoon het raster oppervlak (bijvoorbeeld gebruik 75% Ar/25% H2, vermogen 50 W, druk 25 mTorr). Plaats het PDMS blok met het raster gloed-geloosd in een petrischaal. Positie het raster in het instrument Pak het raster gloed-ontladen met de pincet cryoWriter. Zorg ervoor dat de elektromagneet is ingeschakeld; anders inschakelen in de software. De pincet op de elektromagneet monteren en de handmatige micromanipulator schroef gebruikt voor het uitlijnen van het raster plat op het podium, koolstof film kant omhoog. Dubbelklik op “grid_save”. Het microcapillary standpunt zodanig aanpassen dat de tip ca. 10 µm boven het oppervlak van het raster is. Zorg ervoor dat de microcapillary zich vrij over het raster bewegen kan zonder het aanraken van het altijd en overal als nodig de microcapillary een paar micrometers trekken. Ga terug naar het midden van het raster en de nieuwe positie als “grid” opslaan.Let op: Juiste naamgeving is verplicht voor de macroscript te werken. Schrijven monster en duik-freeze raster. Spoel de microcapillary met enkele tientallen nanoliters systeem vloeistof en eventuele druppels uit de microcapillary met een pluisvrije weefsel verwijderen. Macroscript te starten. De macro zal de volgende stappen uitvoeren: Afzien van 5 nL (om eventuele luchtbellen op het puntje) en ga naar monster positie. Aspirate 65 nL van monster. Infundeer 5 nL terug in het monsterbuisje. Deze accounts voor systeem speling en toestaan van gesynchroniseerde schrijven, dwz., om te zorgen dat verstrekking en verkeer start fase op hetzelfde moment. Ga naar “grid”. Initiëren ‘schrijven patroon’, waardoor de microcapillary te bewegen over het raster, gelijktijdig toedieningseenheden 45 nL van monster. Daarna de microcapillary terug te gaan naar het midden van het raster, verlaag het een ander 10 µm en trekken van overtollige monster vloeistof. De microcapillary trekken en uitschakelen van de elektromagneet. Dit brengt de sprong van het pincet en initieert bevriezing. De pincet greep en zorgvuldig laat de magnetische adapter van de zuiger. Snel het raster van de cup ethaan overboeken naar de cryogen container met de cryo-box en het raster plaats in een vrije sleuf. 3. eencellige Lysate voorbereiding De microcapillaries voorbereiden electroporation.Opmerking: De taps toelopende (laser-getrokken en geïnspecteerde) gesmolten siliciumdioxide microcapillaries heb een bescherming polyimide coating aan de buitenkant, behalve voor de tip, waar de coating af tijdens het toelopende wordt verbrand. Om de jas de microcapillaries met een geleidende laag, monteren ze onder een hoek van 45° op een metalen spoor, met de uiteinden naar boven gericht. Gebruik een aluminiumfolie te beschermen van de onderkant (2 cm) van de tips, als ongecoat polyimide het beste zegel met de pers-fit connectoren die later in dienst vormt. Sputter storten een kleverige laag van 20 nm Ti/W, en vervolgens een 200 nm-dikke laag van Pt. De microcapillary tip hydrofoob maken Bereid een 1 M-oplossing van 1-dodecaanthiol in EtOH. De microcapillary in de lucht voor 1 min met 100 W vermogen bij 0.4 mbar gloed-ontlading. Dompel het topje van de microcapillary in de 1 M-oplossing van 1-dodecaanthiol voor een paar uur (idealiter ‘s nachts).Opmerking: Het is het beste om te bereiden tips vers één dag vóór gebruik. Installeer een nieuwe microcapillary. Verwijder de microcapillary uit de 1-dodecaanthiol-oplossing, spoel de buitenkant met ethanol en spoel de binnenkant met behulp van een spuit met ethanol.Opmerking: Als er geen functionalized microcapillaries beschikbaar zijn, snel gloed kwijting van het puntje van een microcapillary en dompel het in een daling van de commerciële auto vensterbehandeling, dat een mengsel van PDMS en zwavelzuur is. De resulterende hydrofobe functionalization is niet zo goed als met 1-dodecaanthiol, maar over het algemeen voldoende. Klieven zijn ongecoate einde met een capillaire cutter.Opmerking: Een schoon gesneden is belangrijk voor een goede afdichting met de pers-fit-connector. Gebruik een tandenstoker te passen zilveren plak op de scherpe grens gevormd tussen glas en de coating van polyimide, wanneer de coating van polyimide werd verbrand uit door de laser tijdens het capillaire trekken.Opmerking: Deze versterking is noodzakelijk omdat de Pt-coating heel zwak in deze regio is, en elektrische geleiding gemakkelijk kan breken. Wassen het polyimide einde van de microcapillary met aceton. Laat een kleine daling van aceton eind en plaatst u deze in de opening van de pers-fit-connector. Oefen lichte druk uit om te vormen van een goede afdichting. Kalibreren van het microcapillary standpunt. Het instrument inschakelen en opstarten van de software, zoals beschreven in stap 1.1. Bovendien, de Microscoop camera en de functiegenerator te initialiseren. Plaats een glasplaatje Microscoop in de dia houder op de Microscoop. Verlaag de microcapillary dicht bij het glasplaatje en centreren over de doelstelling van de Microscoop totdat het webonderdeel in de cameraweergave Microscoop verschijnt. Gebruik de lineaire stadia van x – en y-as om de positie van het topje van de microcapillary in het midden van de afbeelding. Dan langzaam lager de tip totdat het iets het glasplaatje raakt.Let op: Zeer kleine stapjes (5 µm) naar de definitieve aanpak kiezen. Anders kan de tip worden beschadigd. Druk op de knop “Kalibreren mondstuk”. Dit trekt de microcapillary 40 mm en sets dit positioneren als home positie. Voorbereiding van de afgestempelde PDMS stukken en ITO dia ‘s Mix PDMS en crosslinker in 10:1-verhouding, giet in een groot petrischaal tot een diepte van ongeveer 2-3 mm. bak bij 60° C voor een paar uur in een kruising incubator of soortgelijk apparaat. Met een hamer en een stempel (12 mm diameter), gaten in de PDMS laag gesneden. Daarna kunt een scalpel Knip 2 cm lange vierkanten of rechthoeken met inbegrip van de gaten om te verkrijgen gestempelde stukken die op een microscoopglaasje passen. Meestal zijn twee gestempelde stukken gemonteerd op een microscoopglaasje. Het wassen van de PDMS stukken en de ITO-dia’s eerst met afwasmiddel en daarna met 70% ethanol. Plaats ze, NAT, in een petrischaal en de ethanol volledig laten verdampen in een oven op 60° C. Gloed-kwijting de ITO-dia’s voor 1 min met 100 W vermogen bij 0.4 mbar en vervolgens 1 mL van de oplossing coating (b.v., poly-L-lysine (PLL)) toe te passen. Incubeer gedurende 5 min, verwijderen van de oplossing met een pipet en toepassen van 1 mL van ddH2O. iets doorroeren voor 1 min en verwijder de ddH2O met behulp van een precisiepipet. Laat die de dia’s droog op 60° C. Voorbereiden van de cultuur van de cel. Volg aanhanger-cel kweken standaardprotocol (b.v., Arnold, et al.. 24 , 25). cellen op ITO zaad tijdens normale splitsen/passaging loopt. Neem een vers PLL-gecoate ITO dia en voeg een PDMS stuk. Sommige pressiemiddelen te vormen een waterdichte afdichting. Dit produceert kleine putjes met de dia als hun basis. Voeg ongeveer 300 µL van cellen geschorst op vers medium de PDMS putjes. De seeding dichtheid dient ongeveer 75.000 cellen per putje. Incubeer de ITO-dia’s gedurende 1-2 dagen onder standaardomstandigheden. Voorbereiden op experiment lysis van de cel: Vooraf warm een paar milliliter van de electroporation buffer (bijvoorbeeldfosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)). Set-up voorbereiden op NS-EM raster voorbereidingOpmerking: Details voor het voorbereiden van de installatie zijn weergegeven in stappen 1.1-1.5 (voor NS) of stap 2.1-2.4 (voor cryo). Hier beschrijven we de belangrijkste stappen voor NS-voorbereiding. NS voor te bereiden door het invullen van een 100 of 200 µL PCR buis met 100-150 µL van NS (b.v., verkrijgbare 2% methylamine wolframaat). Plaats de buis op de steun van de gekoelde monster van het instrument. Verplaats de microcapillary naar de NS PCR-buis, de tip onderdompelen in de NS-oplossing en opslaan van deze positie als “vlek”. Het laden van de lysis van de standaard parameters, bijvoorbeeld, de lysis van de spanning. Neem de ITO-dia uit de incubator en het monteren op de Microscoop invoegen. Gebruik twee schroeven om de fix van de dia op de aluminium invoegen en om elektrisch contact tussen de ITO coating van de dia en het elektrisch geaarde aluminium frame. Verwijder het kweekmedium cel en spoel tweemaal met 300 µL van electroporation buffer. Houd de cellen electroporation buffer. Plaats het aluminium invoegen de ITO-dia te houden in de live-cel incubator fase op de setup. Zoek de celcultuur in het microscopisch beeld en kies een gebied met geen cellen. Aanpak van het uiteinde aan de oppervlakte van de ITO en zachtjes aanraken, dan trekken de tip 100 µm en de positie van de als “cellen” opslaan. Snel verlaten de celcultuur en spoelen van het uiteinde van de microcapillary met enkele tientallen nanoliters systeem vloeistof dan zet het in de cultuur van de cel weer. Afzien van een paar nanoliters tijdens de onderdompeling in het PDMS goed om ervoor te zorgen dat geen lucht bubbels aan het uiteinde zitten. Zachtjes benaderen het ITO-oppervlak (in eerste instantie moet u op positie “cellen”, dwz., 100 µm boven het oppervlak). Intrekken bij contact, tip 10 µm. Selecteer een nabijgelegen cel voor lysis. Plaats het uiteinde van de microcapillary boven de gerichte cel. Start de macroscript voor lysis van de eencellige. Naam de positie van de microcapillary moet worden verplaatst naar na een cel heeft met succes zijn lysed. Dit zal het NS reservoir (NS-EM), een demineralisatie buffer (cryo-EM) of het EM-raster (cryo-EM). Spelfouten voorkomen en druk op “ok”. De macro wordt uitgevoerd zonder tussenkomst van de gebruiker: i) de Microscoop fase en cel cultuur 100 µm worden verplaatst naar de linkerkant, een momentopname van de gerichte cel is genomen, en 50 nL van ddH2O systeem vloeistof zijn vrijgesteld van de microcapillary. Dit verdringt verdunt de hoge zout buffer en osmotische druk is van toepassing op de cel. II) het podium is verhuisde terug naar de positie van het puntje boven de gerichte cel weer. De uitbarsting van de vooraf gedefinieerde spanning wordt toegepast, en na 500 ms begint de pompsysteem gecombineerd 3 nL van monster op een debiet van 2 µL/min. III) de fase wordt verplaatst naar links weer, waardoor de cel te inspecteren. Een venster verschijnt, vraag voor de invoer van de gebruiker. Zeggen of de lysis stap succesvol of niet was. Als het antwoord is Nee, overnemen, de microcapillary leegmaken en richten een nieuwe cel. Als het antwoord ja is, een momentopname van de verwijderde (lysed) cel wordt genomen en daarna de microcapillary wordt verplaatst naar de locatie die is opgegeven in 3.8.1. Als dit NS of een buffer reservoir, kunt de standaardgebruikersinterface afzien van 3 x 0,5 nL vloeistof terwijl de microcapillary gaat om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen. De tip is ondergedompeld in de reservoir vloeistof door de macro.Opmerking: U kunt blijven voorwaarde van het monster en rasters te bereiden, zoals uiteengezet in secties 1.6.9 – 1.7.9 voor NS-EM of sectie 2.2-2.6 voor cryo-EM. De nodige maatregelen voor de voorbereiding van de NS-raster worden hieronder toegelicht. Laat de microcapillary ondergedompeld gedurende 8-12 minuten, afhankelijk van de geometrie van het mondstukOpmerking: De concentratie van de hoge fosfaat in de buffer vereist een langere tijd van onderdompeling voor conditionering. Afzien van 5 nL van de geconditioneerde cel lysate op het raster. De microcapillary trekken en laat het geconditioneerde monster droge langzaam het werkgebied dauwpunt (DP-fase) 1-2° C boven het dauwpunt temperatuur geregeld. Het raster verwijderen en opslaan bij kamertemperatuur in een raster doos of petrischaal.

Representative Results

De “cryoWriter” setup werd ontwikkeld (afgebeeld in Figuur 2) om te testen de verkleinde EM raster voorbereiding procedures voorgesteld in Figuur 1C, D. Figuur 2 A toont een overzicht van de verschillende componenten gemonteerd op een omgekeerde fluorescentie Microscoop. Een cel-kweken-module is geïnstalleerd aan de linkerzijde van de Microscoop; een module voor EM raster voorbereiding bevindt zich aan de rechterkant. De cel-kweken module (Figuur 2B) kan de groei van aanhangend eukaryotische cellen en live-cel beeldvorming van de cultuur van de cel door de lichte Microscoop. Afzonderlijke cellen zijn lysed door het gecombineerde optreden van osmotische schok, electroporation en aspiratie van de inhoud van de cel in een24,microcapillary (Figuur 2B, Figuur 6A)25. De aanzuiging lysate monster kan vervolgens worden gebruikt om te bereiden rasters voor NS – of cryo-EM. Als alternatief, een oplossing van de voorraad eiwitten in een buis van PCR kunnen de monsterbron. De microcapillary (Figuur 2B) werkzaam is verbonden met een hoge precisie pompsysteem waardoor monster volumes worden aanzuiging en afgeleverd met sub-nL precisie. Zoals uiteengezet in de protocollen, is alle monster verwerking binnen deze microcapillary of op de EM-grid zelf zonder significante steekproef vervoer plaatsvindt. Bijvoorbeeld, wordt de zelfde microcapillary gebruikt lyse individuele eukaryotische cellen, gecombineerd de lysate, conditie van het en tenslotte afzien aliquots op EM rasters. Het raster voorbereiding module bestaat uit een roerende DP-fase waarmee de temperatuur van het EM-raster geplaatst om te worden precies gecontroleerde (Figuur 2C). Bij NS-TEM, kan het voorbereide monster raster vervolgens eenvoudig worden verwijderd uit de koude fase en toegestaan om te drogen in de lucht bij kamertemperatuur. De zogenaamde koffie-ring effecten dat kunnen vervolgens leiden tot moeten echter worden vermeden voor kwantitatieve TEM waar eiwit ‘deeltjes’ worden geteld. Om dit te doen, zijn rasters gedroogd langzaam in het DP-werkgebied met behulp van een geleidelijk aan stijgende temperatuur verloop te vertragen vloeibare verdamping. Voor cryo-EM, wordt de temperatuur van het raster gehouden dicht bij het dauwpunt; een positieve verschuiving van ongeveer 8 ° C is gekozen, zodat de gecontroleerde verdamping van monster vloeistof voor dunne film stabilisatie en vermagering, die kan worden gecontroleerd door een sensor, eventueel26. Na de geselecteerde dunner wordend tijd, een pick-en-duik mechanisme is geactiveerd en het monster is verglaasd (Figuur 2C). Merk op dat dit kelderen mechanisme is niet nodig voor NS-EM rasters die bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Figuur 2: overzicht van het cryoWriter-setup. A) overzicht van de setup van de cryoWriter gemonteerd op een omgekeerde licht-Microscoop (1). B) inzet van gebied aan de linkerzijde in deelvenster A. cel kweken compartiment (2), aangegeven met een microcapillary (3) voor monster manipulatie en cel lysis gepositioneerd boven een verkleinde PDMS gebaseerde cel cultuur plaat (4). C) inzet van gebied aangegeven aan de rechterkant in deelvenster A. ‘Pick-en-wagen’ mechanisme. Een gaten koolstof film EM raster (5) is gemonteerd tussen de uiteinden van het pincet (6) en horizontaal geplaatst in direct contact met de temperatuurgevoelig fase (7), bedoelde als dauwpunt fase (DP-fase) van de hoofdtekst. De fase-temperatuur is streng gecontroleerd via een PID-regelaar en een watergekoelde Peltier element, houden het op of dichtbij de dauwpunt temperatuur, afhankelijk van het omringende milieu. De DP-fase (7) is gemonteerd op een gemotoriseerde xy-as te verplaatsen van het raster ten opzichte van de microcapillary. De microcapillary zelf kan is gemonteerd op een z-fase en worden verlaagd tot het zeer dicht onder de oppervlakte van het EM-raster en gebruikt af te zien van nanoliter middelgrote volumes op de drager van de steekproef bedekken (een continue dunne koolstof laag voor NS-EM of een film van een koolstof voor cr yo-EM). Merk op dat vloeibare opname- en verstrekking wordt uitgevoerd met behulp van een hoge-precisie pompsysteem (8). De verdeelde vloeistof kan worden verspreid door het raster ten opzichte van de microcapillary in een spiraalpatroon te bewegen. Voorbereiding van de cryo-EM brengt de pick-en-duik bevriezing mechanisme (9) snel het raster van steekproef-geladen in vloeibaar ethaan (10) voor snelle koeling en monster verglazing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 toont representatieve resultaten voor NS-EM rasters bereid met behulp van het cryoWriter-setup. Het uiteinde van de microcapillary was geladen met 5 nL van monster van een stamoplossing en gecoate in een reservoir van NS oplossing (2% methylamine wolframaat) voor enkele minuten toe voor uitwisseling van NS en zout ionen (Zie voor een theoretische discussie Arnold, et al. 24). daarna het geconditioneerde monster was afgeleverd op de dunne koolstof-film van een NS-EM-raster en gedroogd. Figuur 3 A toont het gebruik van een raster slot op dezelfde manier te visualiseren van de volledige druppel, zoals vereist voor kwantitatieve TEM. Om te voorkomen dat het effect van de ring koffie, was het raster vers gloed-geloosd in eerste instantie op het dauwpunt temperatuur (geen water verdamping) gehouden en vervolgens langzaam opgewarmd het DP-werkgebied. Let op, dat voor de meeste toepassingen (bijvoorbeeld, kwaliteitscontrole van het monster of structurele analyse) dit proces langzaam drogen niet nodig is. Kwalitatief hoogwaardige NS-preparaten worden verkregen zonder dat, zoals in Figuur 3, onderB, C. Conditionering tijden voor fosfaatvrije laag zout buffers zijn ongeveer 3 min, bijvoorbeeldmet lage-zout Tris-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4 met 50 mM NaCl), zoals aangegeven in Figuur 3B tabak mosaic virus (TMV) gebruiken als voorbeeld. Figuur 3 C presenteert een worst-case scenario, zoals de TMV in PBS buffer (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM nb2HPO4·7H2O, pH 7.4 was). Fosfaat-ionen vormen voorbijgaande kristallen met de zware metalen ionen van NS (Zie Figuur 5C), verlenging van de conditionering benodigde tijd (7 min). Andere zware metalen zouten kunnen ook worden gebruikt met het raster voorbereiding module, bv, 2% methylamine vanadate of ammonium molybdaat (Zie ook Arnold, et al.. 24). uranyl acetaat is echter niet geschikt; het effect van het crosslinking van deze vlek leidt tot aggregaten als de eiwitSteekproef wordt geconditioneerd in oplossing, voordat adsorptie aan een carbon film (Zie Figuur 5E)23. Figuur 3: typische resultaten voor NS rasters bereid met behulp van het cryoWriter-setup, zoals aangegeven in Figuur 1C. A) overzicht beeld van een 3 nL-droplet afgeleverd op een raster slot na conditionering met 2% methylamine wolframaat. B) TMV in 20 mM TRIS buffer. De inzet toont een 3 x vergroting van de aangegeven regio. Aangepast van Arnold, et al.24 (verdere machtigingen aan het materiaal excerpted gerelateerde gericht te worden aan de ACS). C) tabak mosaic virus (TMV) in PBS buffer. De inzet toont een 3 x vergroting van de aangegeven regio. Aangepast van Arnold, et al.24 (verdere machtigingen aan het materiaal excerpted gerelateerde gericht te worden aan de ACS). Schaal bars: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Typische resultaten voor cryo-EM rasters bereid met behulp van het cryoWriter-setup zijn afgebeeld in Figuur 4. Deelvenster 4A toont een raster atlas van het verdragsgebied van verglaasd monster. Deelvenster 4B toont de homogeniteit van het glasvocht ijs in een geselecteerde raster-sleuf. In beide gevallen was het monster 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl buffer met 0,05% Fos 14 wasmiddel. Veel monsters en buffers werden getest en een vergelijkbare hoge kwaliteit glasvocht ice werd verkregen, maar de voorwaarden zijn buffer afhankelijk (Zie ook bespreking van Figuur 5). Paneel 4C toont apoferritin deeltjes en een bacteriofaag in Tris-HCl buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7.4) beeld op hoge defocus te verhogen van contrast. Paneel 4D toont een 200 kDa membraan eiwit gestabiliseerd door amphipoles. Figuur 4: typische resultaten voor cryo-EM rasters bereid met behulp van het cryoWriter-setup, zoals aangegeven in Figuur 1D. De monsters en de buffers variëren in de getoonde voorbeelden. Alle monsters werden geladen op een koolstof films. A) Collage overzicht beelden (“raster atlas”) van een monster met een 150 kDa membraan eiwit, de periferie van het glasvocht ijs wordt aangegeven door witte pijlen. B) Enlarged raster slot uit een raster met de dezelfde buffer, tonen de gaten koolstof-film met glasvocht ijs bereid. Aantal gaten zijn niet gevuld met monster buffer, zoals aangegeven door witte pijlen. C) Carbon gat met verglaasd monster met apoferritin eiwitcomplexen en bacteriofagen. Inzet: tweeledig uitbreiding tonen de staart van een bacteriofaag. Het witte sterretje geeft aan de koolstof-film. Merk op dat de afbeelding werd opgenomen met de hoge defocus te verhogen van contrast. D) A 200 kDa membraan eiwit aangemaakt in amphipols. Inzet: een 2 x vergroting van de aangegeven regio weergegeven met meer contrast. Schaal bars: A, 100 µm; B, 10 µm; C en D, 80 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Het cryoWriter-setup kunt systematische screening voor optimale EM-raster voorbereiding omstandigheden; een voorbeeld is weergegeven in Figuur 5A (apoferritin in 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Fos 14). In dit experiment, het glasvocht ijs “dunner” temperatuur was gevarieerd, maar de dunner wordend tijd (d.w.z., het tijdsverschil tussen de voorbeeldtoepassing en duik bevriezing) constant gebleven (1 s). Laag temperatuurflexibel offset (b.v., 8 K) was de steekproef laag te dik. Bij hogere compensatie temperaturen, het glasvocht ijs in de gaten was dunner (10 K, 12 K), totdat op een gegeven moment (boven 18 K) het raster werd volledig droog (niet afgebeeld). In de resultaten hier gepresenteerd, een offset van 12 K leiden tot een groot homogeen gebied van glasvocht ijs zoals aangegeven door de zwarte pijlen. Dergelijke optimalisatie experimenten kunnen worden uitgevoerd met de buffer van de doelsteekproef met behulp van de “test” eiwitten (zoals apoferritin). De beste voorwaarden gevonden worden vervolgens toegepast op de doelsteekproef. Anderzijds grids met parameters verre van optimaal kunnen vaak worden herkend tijdens de voorbereiding procedure en hoeft niet te worden vertoond in de elektronenmicroscoop, aanzienlijke tijdwinst. Figuur 5 toont ook een galerij van typische cryo-EM (deelvenster B) en NS-EM (panelen C tot en met E) artefacten die specifiek zijn voor het cryoWriter-setup. De cryo-EM-raster wordt weergegeven in het deelvenster 5B met TMV in PBS met 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4136.9 mM NaCl, 8.9 mM nb2HPO4·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) was overdreven uitgedund. De achtergrond van de afbeelding is korrelig, omdat het zoute concentratie te hoog werd. In het algemeen, lijkt de visuele weergave van een steekproef niet te worden van een lineaire functie van de zoutconcentratie; granen ineens prominente wanneer de concentratie van een drempel is bereikt tijdens het uitdunnen. Merk op dat ongewenste stoffen kunnen worden verwijderd door een conditionering stap vóór raster voorbereiding, zoals beschreven voor NS-EM in protocol punt 1.6. NS kan leiden tot andere artefacten. In het voorbeeld in deelvenster 5C, PBS buffer (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM nb2HPO4·7H2O, pH 7.4) zonder monster was voorzien in 2% methylamine wolframaat voor 3 min. precipitaten van airconditioning en kristallen zijn duidelijk en oefenen van de uitgebreide krachten op het oppervlak van de koolstof leidt tot scheuren. De enige vorm van precipitaten in een bepaalde concentratie van PBS en NS variëren en kunnen worden vermeden door het conditioneren van de steekproef voor langere (Vergelijk Figuur 3C). Paneel 5D toont de periferie van een verdeelde NS monster droplet tentoonstellen van een “koffie-ring”. Dit zou verstoren analyse kwantitatieve, totale monster en kan worden vermeden door het vertragen van het droogproces, dat wil zeggen, door het bijhouden van het EM-raster bij het dauwpunt temperatuur tijdens voorbeeldtoepassing, en vervolgens geleidelijk de temperatuur om te drogen) Zie Figuur 3A). Deelvenster 5E (apoferritin in 20 mM HEPES, pH 7.0, geconditioneerde 3 min) ziet u de crosslinking activiteit van 2% uranyl acetaat vlek, die niet kan worden gebruikt om de voorwaarde EiwitSteekproeven voordat ze worden geadsorbeerd aan koolstof film ondersteunt. Figuur 5: systematische veranderingen en artefacten worden waargenomen wanneer de set-up van de cryoWriter werd gebruikt om te bereiden rasters voor NS – en cryo-EM. A) systematische glasvocht ijs dikte variatie; optimalisatie van raster voorbereiding voor cryo-EM. De offset temperatuur van de DP-etappe was gevarieerd (8 K tot 12 K) houden de dunner wordend tijdconstante (1 s). De pijlen geven aan de periferie van de monster-laag. B) zout effecten; ook hooggeconcentreerde, dat wil zeggen, de dunner wordend stap te lang was. De inzet toont een 2 x-uitbreiding van de aangegeven regio. C) zout precipitaten gevormd door PBS buffer in de aanwezigheid van zware metalen zouten. Monsters met PBS buffer moeten langer dan monsters in andere buffers worden geconditioneerd. PBS buffer zonder monster was hier in 2% methylamine wolframaat gedurende 3 minuten, een typische tijd voor andere buffers monster geconditioneerd. Opmerking de spleet in de film van de koolstof meest waarschijnlijk te wijten aan de sterke krachten van de precipitaten handelend op de dunne steun tijdens het droogproces. D) ‘Koffie ring’ effect. E) Apoferritin in 2% uranyl acetaat geconditioneerd voor 3 min. Uranyl ionen aanzienlijke crosslinking activiteit en de apoferritin vertonen clusters formulier grote aggregaten. Schaal bars: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. De kleine hoeveelheid en het volume vereist voorbereiding EM raster met behulp van het cryoWriter-setup kunt nieuwe soorten experimenten. Bijvoorbeeld, kunnen de totale inhoud van een enkele cel worden verzameld en voorbereid voor de NS – en cryo-EM. De procedure wordt aangegeven in Figuur 6A. Een aanhangend, eukaryote cel (HEK 293) is lysed door gelijktijdige electroporation en monster aspiratie (deelvenster 6A)25. Een totaal volume van 3 nL is aanzuiging, die de cel lysate bevat, en wordt opgeslagen in de microcapillary voor verdere verwerking. Voor de NS-EM weergegeven in het deelvenster 6B, werd het kweken van cel medium uitgewisseld met PBS buffer (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM nb2HPO4·7H2O, pH 7.4) voorafgaand aan cellysis. De celinhoud waren aanzuiging in 3 nL van buffer en geconditioneerd in een reservoir van NS zoals aangegeven in Figuur 1C voor 10 min. daarna, een 5 nL volume werd aangeboden op de film continu koolstof van een NS-EM-raster. Individuele eiwitten, bijvoorbeeld, draadvormige actine en membraan patches met bijgevoegde eiwitten kunnen worden herkend in de afbeelding. Voor de cryo-EM, weergegeven in figuur6 C, een volume van 3 nL was afgeleverd op een raster van een koolstof EM zonder opnieuw streven naar vloeistof afzuigen. De relatief dikke film van monster gevormd werd uitgebreid uitgedund voordat verglazing. Om dit te doen, was de temperatuur DP-fase geleidelijk toegenomen, vanaf de temperatuur dauwpunt. De dunner wordend proces werd gevolgd door een real-time sensor-systeem tot een vooraf vastgestelde drempel was bereikt triggering de ‘pick-en-wagen’ mechanisme en monster verglazing (voor details zie Arnold, et al. 26). membraan structuren en eiwitten kunnen worden herkend in de afbeelding. Figuur 6: Single visuele proteomics cel met behulp van de set-up van de cryoWriter. A) Lysis van één aanhangend eukaryote cel. De cel wordt verbouwd (1, groen) op een functionalized, ITO bekleed (rood)-glasplaatje (2) in een verkleinde petrischaal (3)25. De ITO laag is elektrisch geworteld. De cel wordt benaderd door de microcapillary (4), die is bekleed met platina. Een eerste osmotische schok (niet aangegeven) wordt gegeven aan het vergemakkelijken van lysis, die wordt uitgevoerd door een serie van elektrische pulsen en schuintrekken krachten uitgeoefend tijdens de aspiratie van de cel lysate. Het proces kan worden gecontroleerd door de lichte microscopie; het objectief van de Microscoop is aangegeven (5). Voor meer informatie, zie onze eerdere werk24,25. B) NS-EM beeld van lysate uit een afzonderlijke HEK 293-cel. Filamenteuze actine en membraan patches met bijgevoegde eiwitten zijn zichtbaar. Deelvenster aangepast vanaf Arnold, et al.24 (verdere machtigingen aan het materiaal excerpted gerelateerde gericht te worden aan de ACS). C) Cryo-EM beeld van lysate uit een afzonderlijke HEK 293-cel. De inzet toont een 2 x-uitbreiding van de aangegeven regio waar typische membraan structuren met bijbehorende eiwitten zichtbaar zijn. Deelvenster C aangepast vanaf Arnold, et al. 26 schaal bars: B, 50 nm; C, 80 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De ‘cryoWriter’-instrument en de protocollen die zijn vereist voor het bereiden van monster rasters voor NS – en cryo-EM van nL grootte totale steekproef volumes en helemaal vermijden de klassieke papier-bevlekken stap worden gepresenteerd. Microfluidic beginselen en een micromechanische systeem zijn gecombineerd in de cryoWriter dit mogelijk te maken.

Onze ervaring leert dat wanneer de verkleinde methoden gepresenteerd in dit manuscript worden gebruikt, de parameter ruimte voor de voorbereiding van de EM-raster groter dan voor de klassieke methoden, en onder strengere controle van de gebruiker is. Nog belangrijker is, maakt de verhoogde reproduceerbaarheid bereikt het mogelijk om vooraf te controleren met monster buffersysteem, aangevuld met een eiwit beschikbaar test, om te bepalen van de optimale parameters voordat het werkelijke experiment is uitgevoerd. Dit houdt van consumptie van het monster van belang tot een absoluut minimum en wordt sterk aangeraden. Kritische stappen voor de voorbereiding van beide NS – en cryo-EM raster zijn: (i) Priming van de pompsysteem; met betrekking tot sub-nanoliter volume aflevering, moet het systeem vloeistof (water) worden ontgaste en gratis bubble. (ii) nauwkeurige controle van de gloed lozing of plasma schoonmaken stap; de oppervlakte kenmerken van het EM-raster zijn cruciaal voor reproduceerbare resultaten. (iii) monster conditionering; de tijd die nodig is voor het conditioneren, bijvoorbeeldmet de NS, hangt af van de aard van de buffer, de zoutgehalte en de concentratie (Figuur 3), en op de geometrie van het mondstuk van de microcapillary²⁴. (iv) de verdampingssnelheden voor NS-EM preparaten voor kwantitatieve EM; de koffie-ring effect kan verbieden de kwantitatieve analyse van NS-EM preparaten, en moet worden onderdrukt door langzame verdampingssnelheden gecontroleerd door de DP-fase.

Verschillende aspecten van de gepresenteerde raster bereidingswijzen kunnen vrij worden gecombineerd waardoor de ontwikkeling van veelzijdige protocollen voor specifieke monsters. Typische voorbeelden zou de schrapping van een stof die hoge resolutie EM, bijvoorbeeld, glycerol, door een conditionering stap vóór raster voorbereiding voor cryo-EM voorkomt; de invoering van bemiddelaar moleculen, zoals liganden, door conditionering voordat de rasters worden bereid; of het onderzoek van eencellige lysate door NS – of cryo-EM (Figuur 6).

Het gebruik van microfluidics en minimal steekproef bedragen in de gepresenteerde methoden elimineert volledig de noodzaak voor papier-bevlekken stappen. Dit is een groot voordeel, want papier bevlekken een harde behandeling voor eiwitten is, potentieel verontreiniging van de steekproef met ongewenste ionen en inherent leidt tot massale monster verlies. Aan de andere kant, effecten, mogelijk veroorzaakt door de lucht-water-interface van de dunne monster film gevormd wanneer cryo-EM monsters zijn voorbereid op de klassieke manier niet vermeden wanneer de cryoWriter wordt gebruikt. Rasters geschikt voor cryo-EM kunnen bereid worden met een wachttijd van minder dan 0,2 s tussen voorbeeldtoepassing en verglazing (gegevens niet worden weergegeven). Als een paar tienden van een nanometer in een paar nanoseconden eiwitten door diffusie reizen, is er echter nog steeds genoeg tijd voor hen te botsen met de interface van de lucht-water van een 100 nm dikke monster film meerdere malen. Echter, de hoeveelheid eiwitten die vasthouden aan de lucht-water-interface kan aanzienlijk worden verkleind door deze korte tijd leemten en ertoe leiden dat denaturatie van eiwit of particle oriëntatie beperkt. Een andere veelbelovende aanpak die gevoelige eiwitten voor de lucht-water-interface behoeden kan is ter dekking van de film monster door laag molecuulgewicht tensioactieve stoffen. Deze verbindingen kunnen snel worden ingevoerd door een stap van de conditionering in de cryoWriter voor de bereiding van het raster. De hoge verhouding van oppervlakte-naar-volume van microfluidic systemen is een verdere beperking van de cryoWriter, zoals monster potentieel kan worden verloren door aspecifieke adsorptie aan de oppervlakte van de microcapillary en verstoren van kwantitatieve analyse door het tellen van deeltjes. Het probleem is gericht op twee manieren: ten eerste, het monster doet niet reizen lange afstanden binnen de microcapillary. Inderdaad, het monstervolume nanoliter blijft op de capillaire tip tijdens de verwerking. Ten tweede: de oppervlakte volumeverhouding is verder verminderd door het gebruik van microcapillaries met relatief grote innerlijke diameters, b.v., 180 µm. ten derde, de oppervlakken van de microcapillaries kunnen gemakkelijk worden gepassiveerd, indien nodig, bijvoorbeelddoor ze te behandelen met verkrijgbare polylysine ethanol glycolen (PLL-PEG).

De hoge resolutie analyse van eiwitten door de aanpak van één deeltje gebruikt in EM vereist slechts 100.000 tot een paar miljoen beelden van individuele eiwit deeltjes. Dit betekent dat microfluidic technieken genoeg eiwitcomplexen voor de structurele onderzoek bieden kunnen. Een verkleinde immuno-neerslag-methode voor de snelle isolatie van eiwitcomplexen (ongeveer 1 uur) van minimal cel bedragen (ca. 40.000 cellen) werd eerder²⁸ontwikkeld. Deze methode zal nu direct worden gekoppeld aan de fase van de bereiding van het verkleinde monster van de cryoWriter. Het uiteindelijke doel is het ontwikkelen van een pijpleiding van de geïntegreerde microfluidic voor ultrasnelle eiwit isolatie en cryo-EM raster voorbereiding, waarvoor minder dan twee uur in alle. Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 6, het minieme bedrag en de hoeveelheid materiaal dat nodig is voor de bereiding van de monsters en de bijna lossless airconditioning en raster voorbereiding procedure bereikt met behulp van de cryoWriter, het mogelijk maken te bestuderen van het eiwit complexen van afzonderlijke cellen. Samen de verkleinde immuno-neerslag-methode en de cryoWriter de basis leggen voor een nieuwe proteomics methode genaamd “eencellige visuele proteomics”, zoals we onlangs aangetoond voor warmte-schok experimenten²⁴. Data analyse algoritmen gericht op de analyse van “visuele proteomics” beelden worden momenteel getest.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank de workshop van de Biozentrum van de Universiteit van Bazel voor hun steun, S. A. Müller voor kritische discussies en zorgvuldig lezen van het manuscript, A. Fecteau-LeFebvre voor technische bijstand met EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann voor membraan eiwit testen monsters (alle uit de C-CINA, de Biozentrum, de Universiteit van Bazel) en A. Engel, emeritus Universiteit Bazel voor zijn inspirerende gesprekken. Monsters werden beschikbaar gesteld door P. Ringler, M.-A. Mahi, en T. Schwede (Biozentrum, Universiteit van Bazel), P. Leiman (laboratorium van structurele biologie en biofysica, EPFL) en R. Diaz-Avalos (structurele biologie Center, USA New York). Het project werd ondersteund door het Zwitserse Nanoscience Instituut (DNI, project P1401, ARGOVIA project MiPIS) en de Zwitserse National Science Foundation (SNF, project 200021_162521).

Materials

Liquid handling
Microcapillary tip	New Objective	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve	New Objective	CONGAS-1	Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25
Syringe 10 µl	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included)
Syringe pump controller	Cetoni	A3921000093	neMESYS controller
Syringe pump dosing unit	Cetoni	A3921000095	neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor	Meltec	UFT75-AT	Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller	Cooltronic	TC2812	PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40×40 mm
Water-cooling block	–	–	Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base
Water pump	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block	–	–	Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis	Dyneos AG	M-404.2PD	High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage	Prior Scientific	H117EIL5	Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets	Supermagnete	S-05-08-N	Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Electromagnet control PCB board
Solenoid hub	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers	Electron Microscopy Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts	Thorlabs	–	–
Various mechanical parts	Workshop Biozentrum, University Basel	–	Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM	emsdiasum.com	DTF-03523	30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537 SIGMA	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negative stain vanadium based
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negative stain tungsten based
Software
openBEB			The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin)			Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

References

Kuhlbrandt, W. Biochemistry: The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J Microsc. 129, 89-102 (1983).
Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. , (2010).
Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. Electron gun using a field emission source. Rev Sci Instrum. , (2003).
Zemlin, F. Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy. Micron. 25 (3), 223-226 (1994).
Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat methods. 10, 584-590 (2013).
Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).
Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy. J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).
Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors. J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).
Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. Processing of Cryo-EM movie data. Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).
Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy. J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).
Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
Glaeser, R. M. How good can cryo-EM become. Nat Methods. 13, 28-32 (2016).
Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. in . Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).
Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. Connecting µ-fluidics to electron microscopy. J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).
Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy. ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).
Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).
Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).
Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).
Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).