アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

すべてのこのプロトコルに記載されている動物のプロシージャが倫理規程と適切な大学機関動物ケアの承認および使用委員会 (IACUC) に準拠して実行されます。 1. 手術材料やがん細胞の調製 前にオートクレーブ ミクロ解剖はさみ、グレーフェ ピンセット、グレーフェ組織鉗子針縫合カッター ホルダー外科の日とカーテンの適切な番号。酸化エチレンガス (図 1) で 50 μ L のシリンジと 28 ゲージ針を消毒します。 手術、Myc キャップ細胞 10% 牛胎児血清 (FBS) と 37 ° C 5% CO2インキュベーターで 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) 補われる RPMI で 10 cm 皿の前日。発光や蛍光腫瘍監視、適切なベクトルで 293 t 細胞を transfect、その後 0.45 μ m のフィルター レンチ31Myc キャップ セルを変換します。100% 伝達積極性を持つ安定したセルラインを生成するセルを並べ替えます。注: は、無菌条件の下ですべての組織培養を行い、すべての細胞が無料のマイコ プラズマであることを確認します。Myc キャップ32, 本研究で利用したマウスの前立腺癌細胞株は、ホタルのルシフェラーゼと mCherry の両方を安定して表現する導入です。C mycから分離した Myc キャップ セル行 iss-強制こんにち myc マウス、およびこれらの細胞含む増幅アンドロゲン受容体 (AR)、アンドロゲン依存性32と33マウス去勢後 CRPC 腫瘍を形成します。本研究ではすべてのマウスは、6-8 週齢雄/ニュージャージー州 FVB マウスです。代替マウス前立腺癌細胞は、マウスで適切な遺伝的背景と同様、ひと前立腺癌細胞株またはプライマリ患者由来の前立腺癌細胞のマウスで使用できます。最適な注入あたりの細胞数は、代替細胞の経験的に決定する必要があります。さらに、mCherry の代替として GFP、ポジトロン断層法 (PET)、磁気共鳴画像 (MRI) やコンピューター断層撮影 (CT) を含む腫瘍を可視化する画像診断の代替を利用できます。 手術前に、の晩は、雪解けへの 4 ° C でマトリゲル基底膜マトリックスおよびフェノールレッド フリーの氷を配置します。 手術の日、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗ったと 0.25% トリプシン-EDTA をデタッチによって細胞を収集します。10 s と 1 %rpmi とトリプシンを中和する P/s. 5 分間 400 x g で細胞を遠心します。 FBS または P/S なし RPMI 10 mL でセルを洗浄して セルをカウントし、6.67×107セル/mL (1 × 106セル/15 μ L) の濃度で PBS で細胞を再懸濁します。 最終濃度 1 × 106セル/30 μ L で 1:1 PBS/マトリゲル細胞懸濁液を作成するマトリゲルの等しいボリュームを追加し、凝固を防ぐために注射まで氷の上細胞を保ちます。注: は、マトリゲルに細胞懸濁液を準備する 3 h 内イントラ前立腺注射を実行します。以上 5 マウスに前立腺内注射を実行している場合は、新鮮なマトリゲル細胞懸濁液を準備する上記の手順を繰り返します。 2. 術前マウス作製 注: 家のマウス大学動物施設における少なくとも 1 週間手術前に十分な適応を可能にし、動物のストレスを最小限に抑える。手順 2.1 2.6 は、外科医の助手によって実行されます。すべての後の手術の手順は、無菌手技と滅菌手袋と手術器具を使用して外科医によって実行されます。 イソフルラン (商工会議所経由で誘導の 2-5%、鼻の円錐形によってメンテナンスのための 1-3%) を持つマウスを麻酔します。つま先ピンチ反射の消失、完全な誘導を確認します。 マウスの重量を量るし、管理鎮痛ブプレノルフィンの少なくとも 0.05 mg/kg 皮下注: マウス重量 ≥20 g は成功した前立腺内注入に最適です。 角膜の乾燥を防ぐために両方の目に、眼軟膏に潤滑します。 腹部からのすべての毛を剃る。 腹部を手術時手洗い滅菌アルコール ワイプに続いて滅菌非付着パッドを使用しての円形のアプリケーションの 3 つのラウンドで滅菌します。乾燥する腹部を許可します。注: 外科プロシージャの残りの部分、滅菌手袋、手術器械だけ連絡することが滅菌マウス腹部。 きれいな手術顕微鏡の目的の下で直接加熱パッドできれいな表面の上に仰臥位のマウスを転送します。 滅菌ドレープとマウスを小さな穴を腹部の上にカットでカバーします。 3. 内前立腺注入 注: 無菌条件の下ですべての手術手順に従います。顕微鏡やマウス配置のいずれかを調整する非滅菌の他のオブジェクトは外科医の助手によって行う必要があります。 実行、陰茎や包皮腺 (図 1) に優れた腹部の正中線に沿って外側の皮膚の約 1 cm 切開します。 外側の腹部の皮膚と内側の腹部の筋肉間の結合組織の層間ハサミを開くを区切ります。 腸や膀胱 (図 1) を刺さないように筋肉を高めるために鉗子を使用しながら内側の腹部の筋肉のような切開を実行します。 二国間の精嚢 (図 1 a白) の 1 つを見つける/前立腺前葉 (図 1 aブラック)、しばしば後部, 側の, と膀胱 (図 1 a黄色)、しかしこれにわずかに優れているがマウスの間に異なる場合があります。.前立腺前葉は、半透明と白の精液小胞の小彎側に接続されています。 グレーフェ組織鉗子を使用して組織に精嚢 (図 1E) 穴をあけることがなく張力を作成する精嚢の先端をゆっくりと上げてください。 セルがペレットが、異邦人のピペッティング (外科医の助手によって実行されます)、Myc キャップ マトリゲル ソリューションをミックスとゆっくりと気泡を避けるために針に 30 μ L (1 x 10 の6セル) を吸引します。 前立腺前葉の長い軸に平行に、針の傾斜面を慎重に挿入します。ゆっくりと、葉に 30 μ L を注入し、(図 1 f) の漏れを防ぐために針をゆっくりと上げます。前立腺前葉 (図 1) の充血によって十分な注入を確認します。 精嚢と約 30 のマウス外挿入された前立腺葉を慎重に保持、葉の内で部分的に固めるにマトリゲルを許可する s。この時間の間に挿入された前立腺葉で押すことがなく非同所性同種腫瘍の開発を防ぐためにアプリケーターの先端滅菌ポリエステルを使用腹部の携帯ソリューション漏洩を収集します。 耳たぶを圧迫せず腹部に精嚢と前立腺注入の葉に戻ります慎重に。任意の外部組織を交換してください。 5-0 vicryl 吸収逆カット針縫合糸と内側の腹部の筋肉を閉じるに連続縫合を実行します。 縫合 4-0 ナイロン モノフィラメント非吸収性逆カット針縫合糸と外側の腹部の皮膚を閉じますを実行します。注: 滅菌 9 mm ステープルは、外側の腹部の皮膚を閉じるにも使用できます。ただし、縫合糸と対照をなして、彼らは信号のイメージング、後続発光と蛍光腫瘍を妨げます。 (オープン外科医助手) 滅菌エタノール ワイプときれいにすべてのツール、次のマウスを使用する前に乾燥するためのツールの 30 s. ガラス ビーズ滅菌器で配置。 残マトリゲルによる目詰まりを防ぐために注射器や針 (オープン外科医助手) 滅菌生理食塩水をフラッシュします。注: 外科医助手が表示されますすべての操作、注射前に Myc キャップ マトリゲル溶液を混合するすべての非無菌マウスの術前準備およびマウスの術後ケアを実行します。マウスの前立腺内の各プロシージャが 20-30 分必要になりますので、時間を最小限に抑える外科医助手として外科医が現在のマウスを縫合、次のマウスを準備を開始できます。 4. 術後マウス ケア 鎮痛剤メロキシカムの 1 mg/kg の管理すぐにサウスカロライナ、24 h、および手術後 48 時間。 加熱パッドの上半分に配置ない寝具ケージ内回復するマウスを許可します。彼らを取り戻すまで通常の機動性と、活動後、ケージの床の上に食べ物ときれいなケージでそれらを置く手術後、少なくとも 30 分間マウスを監視します。 さらに手術後適切な創傷治癒、体重、グルーミング、および歩行の毎日マウスを監視します。戦いのすべての証拠に個々 のケージに別のマウス。 手術後 14 日以内の任意の残りの縫合糸を削除します。 5. 発光腫瘍イメージング 滅菌フィルター Na+または K+の製造元によって説明し、光から保護として D-ルシフェリンを準備します。 ルシフェリンの体重の 10 μ L/g とマウスの腹腔内ベンゼン挿入します。 34,35と前述したように、少なくとも 10 分後、IVIS スペクトル イメージング システム、画像マウス。 上記34,35として生活のイメージ ソフトウェアを使用して画像を分析します。注: IVIS 画像解析は正常前立腺内注入と実験群間で腫瘍量を正常化する初期の腫瘍の開発を判断するのに役立ちます。ただし、発光や蛍光信号の強さに応じて彩度はで実際の腫瘍の大きさの増加にもかかわらずイメージ定量化、高原を引き起こす可能性があります。したがって、腫瘍の成長の後の段階で IVIS イメージング有用かもしれない画像飽和後治療の成功時に腫瘍サイズの減少ではなくサイズの増加を決定します。 6. 腫瘍、腫瘍の分析のコレクション生存エンドポイント 腫瘍症例の分析を収集し場合、人道的安楽死によって CO2の露出とセカンダリの頚部転位または方法承認 IACUC によってマウスそして腹部から腫瘍を解剖します。腫瘍は前立腺にあるがんをする必要があります。注: 腫瘍前腹壁に添付または腹部全体シードを示し貧しいまたは漏れ前立腺内注入、同所性同種腫瘍と考えはないです。 腫瘍の重量を量る。 腫瘍体積として π/6 × L × W × H を計算 (L = 腫瘍、W の長い軸の長さ = 垂直幅、H = 垂直高さ)。 腫瘍の組織学 (10% 中性緩衝ホルマリンで修正) によって分析することができます, フローサイトメトリー (単一細胞懸濁液を作成)、タンパク質 (組織ライセート RIPA バッファーの準備)、または RNA (RNAlater ですぐに場所組織)。 免疫学的解析、また前立腺腫瘍排水傍大動脈のリンパ節 (図 1 b、オレンジ) と脾臓を収集します。注: 次の生存のためのマウス、このモデルのエンドポイントが出血腹部腹水36の外観として定義や歩行やグルーミング、立毛37を減少しました。生存時間解析のマウスは前と術後鎮痛法 (プロトコル手順 2.2 4.1) を受け定期的に監視する必要があります。マウスは、すべての戦いが発生し、上記のエンドポイント情報のいずれかの出現に人道的に安楽死する必要がある場合、個々 のケージに区切る必要があります。 7. 手術去勢 CRPC をモデル化する 上記を実行、CRPC をモデリングする前立腺内注入プロトコル (プロトコルの手順 1-5)。 少なくとも一週間後、腫瘍の開発の後前述38経由で焼灼、外科的去勢を実行します。 生物発光イメージングによる腫瘍縮小および再発を監視します。去勢後、腫瘍の回帰が 3 日以内に発生して再発は CRPC を表す約 30 日間内で行われます。