Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7
Summary
A identificação precisa de células satélites é essencial para estudar as suas funções sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Este artigo apresenta um protocolo para identificar células satélites em seções de músculo esquelético adulto baseado em imunofluorescência manchando.
Abstract
Imunofluorescência é um método eficaz que ajuda a identificar diferentes tipos de células em secções de tecido. A fim de estudar a população celular desejado, anticorpos para marcadores de célula específica são aplicados em cortes de tecido. No músculo esquelético adulto, células satélites (SCs) são as células-tronco que contribuem para a regeneração e reparação muscular. Portanto, é importante Visualizar e traçar a população de células satélite sob diferentes condições fisiológicas. No músculo esquelético a descansar, SCs residam entre a lâmina basal e a membrana plasmática de miofibras. Um marcador comumente usado para a identificação de SCs no myofibers ou em cultura de células é a proteína emparelhados caixa Pax7. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência Pax7 otimizado em seções de músculo esquelético é apresentado que minimiza a mancha não específica e plano de fundo. Outro anticorpo que reconhece uma proteína (laminina) da lâmina basal também foi adicionado para ajudar a identificar os protocolos de SCs. Similar também pode ser usado para executar a rotulagem duplos ou triplos, com Pax7 e anticorpos para proteínas adicionais de interesse.
Introduction
Músculo esquelético é composto de células musculares multinucleadas, chamado myotubes, organizado em myofibers, que geram força e movimentos através de contração. Mais os músculos esqueléticos, com exceção de alguns músculos craniofaciais, são derivados de uma estrutura temporária embrionária chamada um somite1. Células precursoras miogênico delaminate partir do somite epitelial tornar mioblastos. Mioblastos mais diferenciarem em miócitos que fundem-se para tornar-se myotubes para formar myofibers multi nucleada. O processo acima é chamado myogenesis e é caracterizado pelo controle temporalmente-regulado da expressão do gene. Miogênico precursores expressam Pax3 e Pax7, Considerando que mioblastos expressam MyoD e/ou Myf5 e miócitos expressam Miogenina e myosins2,3. Crescimento muscular é um processo em que myofibers se tornam maiores, incorporando mais myonuclei em fibras existentes (hiperplasia) e pelo aumento da fibra muscular (hipertrofia) de tamanho4. Durante o crescimento muscular, há uma fonte sustentável de miogênico células que possuem propriedades de célula-tronco, em que eles podem diferenciar e auto renovar. Estas células são denominadas células satélites com base em sua localização física entre a sarcolema (membrana celular das miofibras) e a lâmina basal5. SCs vigorosamente contribuem para o crescimento muscular na fase juvenil (as primeiras 2-3 semanas de ratos pós-natal), mas tornar-se quiescente no músculo adulto6a descansar. Surpreendentemente, eles podem ser re-ativados em resposta ao músculo fere e se diferenciar em células de músculo novo para reparar o músculo danificado7.
As propriedades de célula-tronco fazem o estudo da SCs relevantes para biologia básica muscular e terapias de músculo doenças8. Como resultado, ele tem sido uma área de intensa investigação nas últimas décadas. Fez um tremendo progresso em dissecando a genética e epigenética de SCs9,10. Técnicas envolvidas no isolamento e identificação de SCs em situ foram desenvolvidas e optimizadas ao longo do caminho11. A coloração imunofluorescente permite a identificação de SCs através do uso de anticorpos específicos, inclusive para Pax7. No entanto, a escassez e o tamanho pequeno das SCs combinada com uma forte autofluorescência do tecido muscular esquelético adulto processam a visualização desafiador. Aqui, descrevemos um protocolo de coloração imunofluorescente otimizado para o tecido do músculo de rato para Pax7 e com base em um método existente para zebrafish muscular12. Além disso, um anticorpo de laminina rotulado com um fluoróforo distinto é empregado para identificar a lâmina basal sob as quais se situam os SCs. Este protocolo consistentemente permite a visualização de SCs Pax7-positivo e precursores miogênico sob condições fisiológicas tudo testadas e estádios de desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima foi baseado em um método de coloração de Pax7/MF20 no zebrafish músculo esquelético12. As soluções utilizadas e bloqueando os passos são idênticos ou semelhantes. Os anticorpos utilizados são idênticos. As etapas ajustadas basearam-se nas características do tecido muscular de rato e SCs. Primeiro, laminina anticorpo foi adicionado na mistura para ajudar a visualizar e confirmar a posição do SCs. Foi particularmente útil para contar o número de SCs sob o microscóp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a seção de Imaging luz NIAMS para fornecer os microscópios e a ajuda técnica. Os anticorpos MF20 e Pax7 foram obtidos de estudos do desenvolvimento do Hybridoma banco desenvolvido sob os auspícios dos FORMULADORES e mantido pela departamento de ciências biológicas, da Universidade de Iowa, Iowa City. Este trabalho foi financiado pelo programa Intramural de pesquisa, NIAMS, do institutos nacionais da saúde.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
