Summary

マウスの唾液腺機能の測定法

Published: January 25, 2018
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Summary

唾液腺機能低下は自己免疫病と放射線療法の頻繁に結果です。これらの疾患のマウスモデルにおける唾液腺機能の再現性の評価は、技術的な挑戦です。ここでは、マウスの唾液の分泌の正確かつ再現可能な測定のための簡単な方法を説明します。

Abstract

外分泌腺に影響を与える自己免疫疾患シェーグレン症候群患者唾液腺の炎症を起こすし、唾液の生産を減らした。同様に、唾液の分泌は、頭頸部がんの放射線治療を受けている患者の侵害が深刻です。齧歯動物モデル、これらの臨床条件を模倣するために開発は疾患の病態の理解を容易にして新しい治療戦略の開発を可能にします。したがって、正確に、再現性をもって、繰り返し動物モデルで唾液腺の機能を測定する能力は重要です。以前文献で説明されている手順を踏まえ、方法はこれらの基準を満たしているとマウスの唾液腺機能の評価に使用されたを開発しました。この新しいメソッドの追加の利点は、それが簡単に習得し、そしてオペレーター間の変動が小さいをことです。唾液腺機能は、数量 (重量又は容積) または唾液ピロカルピン刺激に反応して生成率 (mL/分) として評価されます。採取唾液タンパク質含有量、免疫グロブリン濃度と他の生体分子の解析のためのよい源であります。

Introduction

唾液腺は、様々 な神経学的および力学的刺激1に対して唾を生成します。刺激は、腺のアドレナリン作動性およびコリン作動性受容体に交感神経と副交感神経の神経系を介して実行されます。ピロカルピンは、ムスカリン受容体に作用する主にコリン作動性、パラ交感神経エージェントです。唾液腺には、M31ムスカリン性アセチルコリン受容体に作用して唾液の生産を誘発します。ピロカルピン投与唾液の分泌唾液腺の刺激に応答する能力の指標であるし、唾液腺の機能の尺度として使用されます。

シェーグレン症候群2頭頸部がん治療3放射線障害などの唾液腺疾患における唾液の生産の正確な測定が欠かせません。齧歯動物の唾液の分泌を測定するさまざまな方法が開発されています。排泄の唾液腺導管45真空下で口腔内から唾液のコレクション、ガラス毛細管6またはピペット7,8,を使用して、コレクションの直接穿刺が含まれます9. 直接唾液腺導管の穿刺が最も正確かつ純粋な唾を提供します。ただし、これは技術的に挑戦的な手順、管の損傷を引き起こす可能性を排除する同じ動物から反復唾液コレクション。真空下で唾液を収集管から唾液の乾燥により、変数の結果につながることができます。この損失は、減らされた唾液を持つマウスでさらに誇張されています。ただし、病気の状態で分泌される唾液の粘度の変化により、毛細血管の効率的な充填、ガラス管許可以降の解析のための唾液のコレクション。さらに、残留唾液を収集するために口腔内を掃除しようは、怪我につながることができます。ピペット法は、完全なコレクションと同じ演算子の実験間非常に一貫しています。しかし、未知の理由のためこのメソッドは差の異なる演算子を示しています。したがって、適切に比較できるように、同じ演算子は、特定のプロジェクトに関連するすべての実験を実行することが不可欠なります。明らかに、これは実験室の主要な不利な点を表します。

これらの問題を克服するためにプロシージャを組み合わせた唾コレクション メソッドを人間および齧歯動物の使用をしました。ピロカルピン誘導唾液量を測定するため下記綿棒の方法は、簡単に再現できる、オペレーターによって影響されないと同じ動物で繰り返し実行することができます。さらに、タンパク質や他の生体分子、免疫グロブリン、以降の解析に唾液を収集できます。

Protocol

下記プロトコルは機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、健康の国民の協会によって倫理的なガイドラインに従うこと。このレポートに表示されるすべてのデータは、10-12 週齢をした雌のマウスを使用して生成されました。マウスの次の系統が使用された: (B6XA/J) F1、129S、DBA1 BALB/c C57BL/6。すべてのマウスが特定病原体フリーの条件でバリア ケージ (檻ごと 5 動物) に収容され、飼?…

Representative Results

実験的マウス モデル システムにおけるピロカルピン刺激への応答の唾液を生産する能力、唾液腺機能の指標として使用されます。唾液の分泌は、綿棒法による 11 週齢の c57bl/6 雌マウスで測定しました。図 1 aで結果は唾液 (mg) 収集したピロカルピンの用量増加を次の量として表されます。1 mg/kg 体重の投与量でマウスのいくつかで遭難 (不本意?…

Discussion

唾液の分泌は複雑なプロセスであり、多くの要因に影響されます。したがって、測定実験動物の唾液腺機能は、挑戦をすることができます。追加の課題は、同じ動物の唾液腺機能の繰り返し測定が病気の発症を確立する次の治療回復を示す、または必要なことです。

このレポートで説明した綿棒方法は技術的にデータを表す複数のオプションを実行する簡単です。得ら?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

研究は、国立衛生研究所、国立歯科頭蓋顔面研究 (DE025030) からの助成金によって支えられました。

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

References

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Cite This Article
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

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