Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans
Summary
De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.
Abstract
De polysaccharide capsule van Cryptococcus neoformans is de primaire virulentiefactor en een van de meest algemeen studeerde aspecten van deze pathogene gist. Capsule grootte sterk kan verschillen tussen stammen, heeft de mogelijkheid om snel te groeien wanneer ingevoerd om stressvolle of lage nutriënten voorwaarden en heeft al positief gecorreleerd met de virulentie van de stam. Om deze redenen is de grootte van de capsule van groot belang voor C. neoformans onderzoekers. De groei van de C. neoformans capsule wordt veroorzaakt tijdens de fenotypische test om te helpen begrijpen van de effecten van verschillende behandelingen op de gist of grootte verschillen tussen stammen. Hier beschrijven we een van de standaardmethoden voor capsule inductie en Vergelijk twee aanvaarde methoden van kleuring en het meten van de diameter van de capsule: (i) Oost-Indische inkt, een negatieve vlek, gebruikt in combinatie met de lichte microscopie van conventionele en (ii) mede kleuring met fluorescente kleurstoffen van zowel de celwand en de capsule gevolgd door confocale microscopie. Tot slot laten we zien hoe de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gebeitste monsters kan worden geautomatiseerd met behulp van computationele beeldanalyse.
Introduction
Invloed zijn op een kwart miljoen mensen per jaar, wat resulteert in meer dan 180.000 doden jaarlijks is Cryptococcus neoformans een pathogene, intracellulaire gist en de verwekker van cryptococcosis1,2, 3. zwaarst getroffen zijn HIV-positieve patiënten in arme landen die niet hebben klaar toegang tot antiretrovirale therapie, waardoor ze zeer gevoelig voor de ziekte4,5,6. Gegevens van de CDC blijkt dat in sub-Saharisch Afrika, C. neoformans meer mensen dan tuberculose jaarlijks en meer elke maand dan een Ebola-uitbraak op record1 doodt. De meest voorkomende route van blootstelling treedt op tegen het inademen van gedroogde sporen die gemeengoed in de omgeving-7 zijn. Bij binnenkomst van de longen, zijn er verschillende Virulentiefactoren die aan het succes van C. neoformans binnen besmette personen bijdragen. De polysaccharide capsule wordt beschouwd als de microbe van primaire virulentiefactor, aangezien acapsular stammen niet virulente8.
De cryptococcal capsule bestaat uit drie onderdelen van het principe: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), en mannoproteins (MPs)9. Terwijl MPs een relatief kleine celwand-geassocieerde onderdeel van de capsule zijn, ze zijn immunogeen en een meestal pro-inflammatoire respons9,10kunnen bevorderen. In tegenstelling, GXM en GalXM maken het grootste deel van de capsule (> 90% van het gewicht) en immunosuppressieve effecten11hebben. Naast de immunomodulerende gevolgen ervan creëert de snelle uitbreiding van de capsule in vivo een mechanische barrière naar inname door gastheer fagocytische cellen (dat wil zeggen, neutrofielen en macrofagen)12. De capsule C. neoformans en de synthese zijn complex, maar overall, verhoogde capsule diameter is gecorreleerd met verhoogde virulentie6,13,14. Gezien dit, is het belangrijk voor C. neoformans onderzoekers om snel en nauwkeurig kwantificeren capsule metingen te kunnen.
Zowel de cel C. neoformans en haar polysaccharide capsule zijn dynamische structuren en wijzigingen weergeven over tijd15. De capsule kunt wijzigen in dichtheid, de grootte en vergadering in reactie op veranderingen in het ontvangende milieu16,17,18. Laag ijzer of nutriëntengehalten, blootstelling aan serum, de menselijke fysiologische pH en verhoogde CO2 zijn bekend tot capsule groei16,18,19,20. Verder, onderzoekers hebben aangetoond structurele veranderingen ten gevolge aanzienlijke verschillen in de immunoreactivity tijdens een infectie, leningen een voordeel aan C. neoformans over de Heerscharen21,22. Dit is bekend omdat de architectuur van de capsule C. neoformans heeft geanalyseerd in een verscheidenheid van manieren. Elektronenmicroscopie, bijvoorbeeld, is gebleken dat de capsule een heterogene matrix met een elektron-dichte binnenlaag onder een buitenste, meer doorlatende laag23 heeft. Lichtverstrooiing en het gebruik van optisch pincet hebben onderzoekers verder het ophelderen van de macromoleculaire eigenschappen24toegestaan. Het analyseren van de resultaten uit beide metingen van statische en dynamische lichtverstrooiing, weten we dat de polysacharide capsule een complexe vertakkende structuur23 heeft. Optisch pincet zijn gebruikt om de test van de stijfheid van de structuur, alsmede het evalueren van de antistof reactiviteit24. Maar is verreweg het vaakst werkzaam analyse van de capsule C. neoformans de meting van de grootte.
Om te kwantificeren capsule grootte, onderzoekers gebruiken wat moet een eenvoudige meting: de lineaire diameter van de capsule. Digitale microscopen worden gebruikt om beelden van meerdere C. neoformans cellen (in het algemeen honderden) gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescente kleurstoffen te vangen. De grootte van elke cel lichaam en omliggende capsule wordt gemeten. De gegevens zijn samengesteld, en de gemiddelde diameter van de capsule wordt berekend door de diameter van de cel lichaam van de diameter van de gehele cel (cel lichaam + capsule) af te trekken. Tot dit punt, zijn deze metingen gedaan handmatig. Terwijl in het algemeen nauwkeurig, heeft deze methode nadelen voor onderzoekers. Grote gegevenssets kunnen nemen dagen of zelfs weken te analyseren met de hand. En omdat deze metingen zijn handmatig gedaan, subjectiviteit en menselijke fouten het resultaat kunnen beïnvloeden.
Geautomatiseerde computationele beeldanalyse is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor onderzoekers op vele terreinen van moleculaire celbiologie, waardoor snellere en meer betrouwbare analyse van biologische beelden 25,26,27. Nauwkeurige beeld analysetechnieken zijn nodig om de kwantitatieve gegevens uit wat vaak complexe en enorme gegevenssets zijn. Echter, sommige metingen, met name het meten van C. neoformans capsule, moeilijk geweest te automatiseren. De interface tussen de celwand en capsule, die over het algemeen wordt weergegeven als een donkere ring wanneer beeld door fase contrast microscopie, nauwkeurig te identificeren kan worden lastig op te lossen met behulp van een eenvoudige drempel. Verder, C. neoformans cellen in cultuur de neiging om het groepje samen en nauwkeurige segmentatie van de cellen is noodzakelijk voor nauwkeurige metingen.
Het doel van dit project was om (i) illustreren een van de standaard protocollen voor capsule inductie in C. neoformans, (ii) vergelijken en contrast Oost-Indische inkt en fluorescentie kleuring als ze betrekking hebben om de capsule van de diameter van de metingen, (iii) de ontwikkeling van eenvoudige, computationele methoden voor het meten van de diameter van de capsule met behulp van beelden van de Oost-Indische inkt gekleurd cellen met behulp van de software van de analyse van een afbeelding, en (iv) beoordeling van de voordelen en beperkingen van het meten van de diameter van de capsule handmatig en met behulp van de software automation. Wij vinden dat de kleuring gemakkelijkst, fluorescerende etikettering van de celwand en capsule, terwijl meer tijd in beslag, de meest consistente resultaten tussen experimenten opgeleverd. Echter beide methoden ingeschakeld ons succesvol onderscheiden tussen lab en klinische C. neoformans capsule spanningen vertonen verschillende maten. Verder konden we automatiseren de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gekleurde beelden en vond dat dit een levensvatbaar alternatief voor handmatige meting van de capsule.
Protocol
Representative Results
Discussion
De capsule is al decennia een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek voor zowel mycologen en clinici geïnteresseerd in C. neoformans en cryptococcosis vanwege zijn rol als een belangrijke virulentiefactor voor het pathogene agens oplevert. Met behulp van microscopie te meten van verschillen in capsule grootte tussen stammen en onder verschillende groei kunnen voorwaarden bieden belangrijke informatie over het pathogene agens en de reacties op verschillende stimuli (d.w.z., verschillende milieu-omst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de moleculaire Biosciences (MOBI) doctorale programma en de biologie-afdeling op Middle Tennessee State University (MTSU) voor het verstrekken van de financiering voor deze studie. Het project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door een speciale projecten subsidie toegekend aan D.E.N. door de MTSU Foundation.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
