Drosophila melanogaster लार्वा में हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए एक Burrowing/सुरंग परख
Summary
प्रोटोकॉल एक सरल परख का वर्णन करने के लिए Drosophila melanogaster लार्वा है कि सामांय वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के तहत हाइपोक्सिया का सामना कर रहे है की पहचान । इस प्रोटोकॉल hypoxic लार्वा अन्य म्यूटेंट से प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए अनुमति देता है कि अतिव्यापी phenotypes जैसे छाई या धीमी वृद्धि दिखाने.
Abstract
पशुओं में ऑक्सीजन वंचित कम वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के लिए जोखिम से या आंतरिक ऊतक क्षति है कि ऑक्सीजन वितरण के साथ हस्तक्षेप से परिणाम कर सकते हैं । यह भी संभव है कि ऑक्सीजन सेंसिंग न्यूरॉन्स के ंयायपालिका व्यवहार सामान्य ऑक्सीजन के स्तर की उपस्थिति में हाइपोक्सिया की तरह व्यवहार पैदा कर सकता है. D. melanogasterमें, कम ऑक्सीजन स्तर पर विकास लार्वा चरणों के दौरान विकास और सुस्त व्यवहार के निषेध में परिणाम है । हालांकि, ऑक्सीजन घाटे के इन स्थापित अभिव्यक्तियां काफी कई उत्परिवर्तनों कि विकास को विनियमित, तनाव प्रतिक्रियाओं या गतिवान के phenotypes के साथ ओवरलैप । परिणाम के रूप में, वहां वर्तमान में नहीं है मैं पहचान के लिए उपलब्ध परख) सेलुलर हाइपोक्सिया एक उत्परिवर्तन या द्वितीय द्वारा प्रेरित) हाइपोक्सिया-व्यवहार की तरह जब असामांय ंयूरॉंस व्यवहार द्वारा प्रेरित किया ।
हमने हाल ही में दो विशिष्ट व्यवहार D. melanogaster लार्वा की पहचान की है जो सामांय ऑक्सीजन स्तर पर हाइपोक्सिया के आंतरिक पता लगाने के उत्तर में होते हैं । सबसे पहले, सभी चरणों में, इस तरह के लार्वा खाने में burrowing से बचते हैं, अक्सर एक खाद्य स्रोत से दूर भटक जाते हैं । दूसरा, एक नरम बुनियाद है, जो आम तौर पर घूमते तीसरे instar चरण के दौरान होता है में सुरंग पूरी तरह से अगर लार्वा hypoxic है समाप्त हो गया है । परख यहां वर्णित का पता लगाने और इन व्यवहार quantitate और इस तरह एक तरह से आंतरिक क्षति से प्रेरित हाइपोक्सिया का पता लगाने के बजाय कम बाहरी ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । एक आगर बुनियाद और खमीर पेस्ट के एक केंद्रीय प्लग के साथ परख प्लेटें लार्वा जीवन के माध्यम से पशुओं का समर्थन किया जाता है । लार्वा की स्थिति और स्थिति प्रतिदिन ट्रैक की जाती है क्योंकि वे पहले तीसरी instar से आगे बढ़ते हैं । भटकना चरण के दौरान आगर उपबुनियाद में सुरंग की हद तक NIH ImageJ का उपयोग कर pupation के बाद quantitated है । परख मूल्य का निर्धारण जब हाइपोक्सिया एक उत्परिवर्ती phenotype का एक घटक है और इस तरह के सवाल में जीन की कार्रवाई की संभव साइटों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में होगा ।
Introduction
आणविक आनुवंशिक उपकरण की परिष्कृत सरणी melanogaster में उपलब्ध evolutionarily जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान जीव बनाते हैं । प्रमुख आणविक प्रतिक्रियाओं को ऑक्सीजन की उपलब्धता के लिए विकास और D. melanogaster में पूर्व अध्ययनों में संरक्षित होना साबित कर दिया है इन संकेतन रास्ते के सार्वभौमिक घटकों में अंतर्दृष्टि उत्पंन 1,2, 3,4,5,6.
D. melanogaster लार्वा में संवेदी ंयूरॉन फ़ंक्शन को विच्छेदन करने के उद्देश्य से अध्ययन के भाग के रूप में, हम दो व्यवहार प्रतिक्रियाओं कि सामांय ऑक्सीजन स्तर 7पर ऊतक हाइपोक्सिया द्वारा सक्रिय साबित की पहचान की । इनमें से एक, भोजन में चिपमंक करने के लिए विफलता, अत्यधिक Wingrove और O’Farrell 8द्वारा रिपोर्ट कम ऑक्सीजन के स्तर की प्रतिक्रिया से संबंधित है । दूसरा व्यवहार, देर से तीसरे चरण भटक instar के दौरान एक नरम बुनियाद में सुरंग के लिए विफलता, पहले हाइपोक्सिया के रूप में पहचान नहीं की गई थी संबंधित । हमने पाया है कि जंगली प्रकार कम ऑक्सीजन के स्तर को भटक लार्वा को उजागर भी 7, इस प्रकार की स्थापना है कि इन दोनों व्यवहार हाइपोक्सिया से शुरू-या तो ऊतक क्षति से प्रेरित या कम ऑक्सीजन का सेवन स्तर द्वारा स्थापित है । यहां हम एक परख हम इन दो हाइपोक्सिया प्रेरित व्यवहार है, जो टिप्पणियों के साथ शुरू होता है लार्वा सेने के बाद तुरंत बाद quantitate विकसित किया है का वर्णन ।
प्रारंभिक लार्वा चरणों में Hypoxic प्रतिक्रियाओं पहले जांच नहीं की गई है और इसलिए लार्वा जीवन भर में एक विश्लेषण प्रदर्शन हमारे परख का एक महत्वपूर्ण घटक है । हाइपोक्सिया के स्पष्ट अभिव्यक्तियों के अधिकांश-धीमी गति से विकास, गरीब विकास, और हरकत छाई-लार्वा phenotypes कई उत्परिवर्तनों द्वारा उत्पादित के साथ ओवरलैप । लेकिन हमने पाया है कि हाइपोक्सिया के साथ केवल तीसरी instar लार्वा टनल 7को पूरी तरह विफलता दिखाती है । इस प्रकार, हमने यह निर्धारित किया कि हमारे hypoxic लार्वा की तुलना में वृद्धि और गतिवान के मामले में भी लार्वा अधिक समझौता करते हैं, फिर भी कुछ सुरंग का प्रदर्शन करते हैं, जबकि hypoxic लार्वा 7की सुरंग नहीं होती । इस परख का एक और मूल्यवान तत्व इस प्रकार है कि यह एक तरह से स्थापित जब हाइपोक्सिया pleiotropic phenotypes के एक विशेष सेट का स्रोत है प्रदान करता है, के रूप में कुछ अंय तनाव या चयापचय खराबी का विरोध किया । परख के एक प्रदर्शन के रूप में, यहां हम निस्र्पक में इसके उपयोग के कम सांस अभिव्यक्ति के साथ लार्वा की प्रतिक्रियाओं का वर्णन un फुलाया, एक जीन है कि लार्वा एयरवेज 9में कार्य करता है ।
हम कल्पना की है कि यह परख मूल्य के निस्र्पक लार्वा phenotypes में लगे शोधकर्ताओं को होगा कि गरीब विकास और सुस्त व्यवहार शामिल हैं । नतीजतन, नए जीन है कि वितरण, उपयोग, या प्रतिक्रियाओं को प्रभावित शरीर भर में ऑक्सीजन की पहचान की जा सकती है । इसके अलावा, एक उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में इस परख शामिल उत्परिवर्तनों कि हाइपोक्सिया उत्पादन की पहचान करने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करेगा । यह परख भी सर्किट है कि हाइपोक्सिया-प्रेरित सहज व्यवहार में लाती है विश्लेषण में मूल्यवान होगा यहां वर्णित है । इस प्रकार के तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण बहुत वर्तमान अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है और melanogaster लार्वा के सरल तंत्रिका तंत्र स्वचालित व्यवहार बाहर विदारक के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है । संवेदी न्यूरॉन्स लार्वा ऑक्सीजन धारणा में शामिल पहले से ही पहचान की गई है, हाइपोक्सिया-प्रेरित प्रतिक्रियाओं के लिए पूर्ण सर्किट को परिभाषित करने की दिशा में एक पहला कदम प्रदान 10,11. GAL4-यूएएस प्रणाली12 के माध्यम से चयनात्मक तंत्रिका पछाड़ना के साथ संयोजन में हमारे परख का प्रयोग तंत्रिका नेटवर्क के आगे घटकों delineating के लिए एक स्पष्ट मार्ग है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां एक सरल डी. melanogaster लार्वा में ऊतक हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए डिज़ाइन परख प्रस्तुत किया है । निदान जल्दी लार्वा जीवन में खाद्य टीले में घटी हुई burrowing पर आधारित है और लार्वा जीवन में देर तक सुरंग के अभाव । लार्वा भीड़ समय से पहले प्रवास के कारण एक खाद्य स्रोत से दूर है और इस तरह परख के एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि लार्वा की एक छोटी संख्या एक बड़े अतिरिक्त भोजन की उपस्थिति में परख रहे है कर सकते हैं । फंजीसाइड मिथाइल-p हाइड्रॉक्सिल benzoate (Nipagen) को आगर प्लेटों में शामिल करना भी परख के दौरान मोल्ड विकास को रोकने के लिए आवश्यक है ।
हम पाते है कि आगर प्लेट परख में परिवर्तनशीलता का एक स्रोत हो सकता है । आमतौर पर, एक ही जीनोटाइप के लार्वा, माता-पिता के विभिन्न बैचों से, या लार्वा के विभिन्न संग्रहों से, परख में उनके व्यवहार में अपेक्षाकृत सीमित भिन्नता दिखाते हैं. इसके विपरीत, आगर विभिन्न दिनों या आगर के विभिन्न बैचों के साथ बनाई गई प्लेटें सुरंग में अंतर उपज कर सकते हैं. एक शर्त इसलिए कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक लार्वा सभी एक ही बैच तैयारी से आगर प्लेट का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिए है । एक ही निर्माण से अलग निर्माताओं या यहां तक कि लदान से आगर उनके बीच बढ़िया तालमेल शक्ति में भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए यह एक इष्टतम जेल प्राप्त करने के लिए यहाँ इस्तेमाल किया 2.2% से ऊपर की ओर एकाग्रता को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हमने पाया है कि जंगली प्रकार के लार्वा आसानी से 3% आगर जैल के माध्यम से चिपमंक कर सकते हैं ।
आदेश में इस परख के मूल्य प्रदर्शित करने के लिए, हम इसका इस्तेमाल किया है tracheae में un फुला या के दमन समारोह के साथ लार्वा में संभावित ऊतक हाइपोक्सिया की जांच करने के लिए। हमारे निष्कर्षों की परिकल्पना के लिए मजबूत समर्थन प्रदान करते है कि इस जीन की सांस अभिव्यक्ति की हानि हाइपोक्सिया उत्पादन कर सकते हैं: btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा भोजन में चिपमंक और बुनियाद सुरंग के दौरान पूर्ण अनुपस्थिति में विफलता दिखाई तीसरा instar । अंय पादी के हमारे पूर्व अध्ययन में, हमने देखा है कि खाद्य burrowing के हाइपोक्सिया प्रेरित नुकसान के रूप में उपबुनियाद सुरंग के नुकसान के रूप में पूरा नहीं है और btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा यहां का अध्ययन इसी तरह व्यवहार किया । इस परख के विफल सुरंग घटक इसलिए हाइपोक्सिया का सबसे मजबूत संकेत प्रदान करता है ।
हालांकि btl-Gal4 > uif RNAi लार्वा हाइपोक्सिया के व्यवहार लक्षण नैदानिक दिखाया, कट(यत)-Gal4 > यूएएस-uif RNAi इन विषमताओं का प्रदर्शन नहीं किया । btl और कट(यत) Gal4 ड्राइवरों विभिंन चरणों में व्यक्त कर रहे हैं, और विभिंन पैटर्न में, लार्वा tracheae के भीतर । btl-Gal4 चालक embryogenesis में अपने विकास से शुरू करने और लार्वा जीवन के माध्यम से जारी सांस प्रणाली भर में व्यक्त की है । इसके विपरीत, कट(यत) से Gal4 अभिव्यक्ति-Gal4 चालक केवल भ्रूण जीवन के अंत में शुरू होता है, tracheae के morphogenesis के बाद, और पृष्ठीय चड्डी के चरम पीछे वर्गों के लिए सीमित है, के प्रमुख अनुदैर्ध्य जहाजों सांस व्यवस्था आहे. इस Gal4 लाइन के साथ uif पछाड़ना इसलिए कम नहीं हो सकता है uif अभिव्यक्ति जल्दी पर्याप्त या मोटे तौर पर पर्याप्त हाइपोक्सिया के कुछ सीमा स्तर के उत्पादन के लिए इस परख में मापा व्यवहार को ट्रिगर करने की आवश्यकता है ।
एक पूर्व अध्ययन में पाया गया कि तीसरे instar लार्वा कम करने के लिए उजागर (10%) ऑक्सीजन के स्तर में कमी की वृद्धि और pupariation 14की शुरुआत में देरी दिखा. btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा का अध्ययन किया यहां तीसरे instar के लिए प्रगति की है लेकिन उनके विकास और pupation दरों पर प्रभाव अधिक स्पष्ट थे: वे काफी छोटे के तहत बहुत कम फैटी ऊतक के साथ नियंत्रण से थे छोटे एपिडर्मिस (चित्र 3) और केवल एक मामूली अंश (~ 10%) pupariation का प्रयास किया । इन मतभेदों का सुझाव है btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा हाइपोक्सिया की अधिक से अधिक डिग्री का अनुभव है, क्योंकि या तो uif में पछाड़ना tracheae अपने पूरे लार्वा जीवन भर में मौजूद था, या क्योंकि यह एक अधिक उत्पादन तीसरे instar में गंभीर ऑक्सीजन अभाव । कैसे tracheae में uif समारोह के नुकसान को रोकने के ऑक्सीजन परिवहन इस बिंदु पर स्पष्ट नहीं है हो सकता है । tracheae के btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा छल्ली (चित्रा 3) के माध्यम से आसानी से दिखाई दे रहे थे, एक संकेत है कि वे हवा में निहित है और इस बात को क्षतिग्रस्त नहीं थे कि द्रव प्रवेश समझौता समारोह । यह औपचारिक रूप से इसलिए संभव है कि सांस नुकसान के द्वारा बनाई गई uif समारोह हाइपोक्सिया नहीं है, बल्कि कुछ अंय दोष है कि सुरंग को रोकता है । पादी के लिए पहले अध्ययन किया, हम निर्धारित किया है कि सुरंग में विफलता LDH mRNA7के ऊंचा स्तर के साथ जुड़ा हुआ है, देर से तीसरे हाइपोक्सिया लार्वा 15में glycolysis और instar के विहित संकेतक । इस प्रकार, btlके लिए हाइपोक्सिया की अंतिम पुष्टि-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा (और इस परख के भविष्य के उपयोग में जांच की लार्वा में) आरटी-पीसीआर शामिल होगा LDH mRNA के स्तर का आकलन करने के लिए या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संकेतक के उपयोग को मापने के लिए intracellular ऑक्सीजन का स्तर (उदाहरण के लिए 16देखें) ।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
करेन एम Qiang राइस विश्वविद्यालय में जॉर्ज जे Schroepfer अनुसंधान पुरस्कार के 2016 प्राप्तकर्ता था । Fanli झोउ चावल विश्वविद्यालय से एक शिक्षण फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर, हार्वर्ड ट्रिप की सुविधा, वियना Drosophila रिसोर्स सेंटर की सेवाओं को कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।
Materials
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
References
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