Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais^1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento^3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença¹, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão⁵ . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos⁶. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo⁷. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto⁸. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características⁶, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato – encefálica,⁹.

Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose⁹ muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue – cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.

Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado⁹. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 – P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.