Profilage de l’acide gras 13C Isotopologue donne un aperçu de transfert trophique de carbone et le métabolisme des lipides des consommateurs d’invertébrés
Summary
L’approche de marqueur trophique acide gras, c’est-à-dire l’assimilation des acides gras comme molécule entière et le transfert dans les tissus de consommateurs mineures ou sans aucune modification, est entravée par les lacunes dans les connaissances dans le métabolisme des acides gras des invertébrés du sol petite. Profilage de Isotopologue est fourni comme un outil précieux pour démêler les interactions trophiques.
Abstract
Acides gras (FAs) sont des biomarqueurs utiles en écologie trophique car ils sont généralement assimilés comme une molécule complète et transférés dans les tissus de consommateurs avec le mineur ou sans modification, ce qui permet le routage alimentaires entre différents niveaux trophiques. Toutefois, l’approche de marqueur trophique FA est encore entravée par la connaissance limitée dans le métabolisme des lipides de la faune du sol. Cette étude a utilisé entièrement marqué l’acide palmitique (C16 : 013, 99 % d’atomes) comme traceur dans les voies de métabolisme d’acide gras de deux sols généralisée collemboles, Protaphorura fimata et Heteromurus nitidus. Afin d’enquêter sur le sort et les modifications métaboliques de ce précurseur, on présente une méthode de profilage d’isotopologue, interprété par spectrométrie de masse avec détection d’ions simples. En outre, l’alimentation expérience en laboratoire en amont est décrite, ainsi que l’extraction et la méthylation des fractions lipidiques dominante (lipides neutres, phospholipides) et la formule connexe et les calculs. Profilage de Isotopologue n’est pas seulement le rendement l’enrichissement global de 13C dans les acides gras provenant de 13C marqué précurseur mais produit également le patron des isotopomères supérieure à la masse de l’ion parent (par exemple, l’ion moléculaire de FA M+) de chacun marqué FA par une ou plusieurs unités de masse (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Cette connaissance permet des conclusions sur le rapport de routage diététique d’une FA entièrement consommée par rapport à la biosynthèse de novo . Le profilage d’isotopologue est proposé comme un outil utile pour l’évaluation du métabolisme des acides gras chez les animaux de la terre à démêler les interactions trophiques.
Introduction
Dans un habitat cryptique comme sol, relations trophiques sont difficiles à aborder et sont plus limitées par la petite taille de la faune. La dernière décennie a vu des avances en écologie biochimique, en particulier dans l’utilisation des acides gras comme biomarqueurs pour définir les stratégies d’alimentation de la faune du sol sous des conditions de champ1,2,3. C’est basé sur le fait que les acides gras provenant de ressources peut être incorporés dans les tissus des consommateurs comme des molécules entières, un processus appelé routage alimentaires4. Transfert des acides gras a été signalé au cours de trois niveaux trophiques, c’est-à-dire des champignons aux nématodes à collemboles5. Récemment, la faune prédatrice était considéré comme6,7 , et les premiers examens des acides gras comme marqueurs trophiques dans les réseaux trophiques du sol ont été publiées8,9.
Plus d’informations sur les interactions trophiques sont atteint par les isotopes stables de l’acide gras sonder (FA-SIP). La détermination de 13C /12C les ratios en acides gras dans les régimes alimentaires et les consommateurs peuvent attribuent des liens binaire et estiment le débit de carbone associé et a été employés en terrestre, eau douce et les réseaux trophiques marins10,11 ,12,13. L’hypothèse de base est que les acides gras alimentaires routés ne sont pas soumis à des processus enzymatiques ; par conséquent, leur 13C signal, c’est-à-dire le 13C /12C ratio de l’acide gras, le consommateur est similaire à celle de l’ alimentation1. Toutefois, une diminution progressive de la signature de 13C vers le haut de la chaîne alimentaire a été signalée dans les systèmes aquatiques, en diminuant une application large de FA-SIP dans études trophique14,15,16. En outre, les connaissances dans le métabolisme des lipides dans la plupart des invertébrés dans les réseaux alimentaires terrestres sont encore limitée.
Comprendre les voies de métabolisme lipidique chez les consommateurs est essentielle pour l’utilisation des acides gras de marqueur trophique comme moyen pour la détermination du flux de carbone quantitatives en écologie trophique. Dans cette optique, 13C-isotopologue de profilage, qui en principe peut être appliqué pour l’enquête sur le métabolisme du carbone de tout système biologique17, est une méthode prometteuse. Suite à l’introduction d’un substrat de carbone marqué 13, la répartition des 13C du réseau métabolique est traçable depuis les produits métaboliques générés dans le spectacle de consommateurs une distribution spécifique isotopologue. Cela peut être évaluée par quantitative résonance métabolique spectroscopie18,19 ou20,spectrométrie de masse à21, avec les échantillons biologiques favorisées dans cette dernière avec faible biomasse en raison de son supérieur sensibilité.
Bien que le profilage d’isotopologue a été avec succès appliqué aux acides aminés et fourni la perspicacité dans le métabolisme de carbone en vivo de bactéries pathogènes17,22,23, sa mise en œuvre en gras les acides a pris du retard. La première analyse détaillée sur le sort d’un isotope stable étiquetés acides gras précurseurs, sa diététique routage ou dégradation par β-oxydation, chez les consommateurs d’invertébrés du sol, a été récemment réalisée par Menzel et al. 24. ici, les bases méthodologiques pour des expériences d’incorporation avec 13C marqué suivis d’isotopologue analyse des principaux descendants en invertébrés du sol fréquents, les collemboles, les acides gras sont fournis. Ces microarthropodes sont un groupe de bons modèles puisqu’elles constituent des éléments importants du réseau alimentaire du sol et sont bien étudiés pour leur marqueur trophique acides gras8,25.
Comprendre les voies de métabolisme lipidique chez les consommateurs est essentielle pour l’utilisation des acides gras de marqueur trophique comme moyen pour la détermination du flux de carbone quantitatives en écologie trophique. Le présent protocole donne la conception et la mise en place d’un laboratoire alimentation expérience ainsi que les processus biochimiques d’extraction et de méthylation des fractions de lipides dominante (lipides neutres, phospholipides) de collemboles. Il montre comment la composition d’isotopologue des acides gras est analysée par spectrométrie de masse et décrit la formule connexe et les calculs. Cette procédure se traduit par : (i) les ratios des isotopomères dépassant la masse de l’ion parent (par exemple, l’ion moléculaire de l’acide gras M+) par un ou plusieurs masse unités (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) et (ii) l’ensemble 13 C un enrichissement en acides gras dérivé du précurseur marqué 13C. Bien qu’utilisé pour les collemboles, cette approche peut généralement être appliquée de toutes les autres relations prédateur-proie sur l’hypothèse que ceux-ci sont cultivables en quantité suffisante dans des conditions contrôlées afin d’assurer une absorption étiquette réussie et suivantes vérification.
Protocol
Representative Results
Discussion
Profil de Isotopologue
Une analyse détaillée des aspects quantitatifs 13C distribution en FAs a besoin d’une technologie de pointe pour assigner carbone partitionnement dans les réseaux trophiques. Le présent travail employé isotopologue profilage pour évaluer le 13C /12C rapports en communs biomarqueurs de FA pour les interactions tropiques. Cette méthode est bien établie pour l’analyse des acides aminés par chromatographie liquid…
Acknowledgements
Tient à reconnaître le soutien financier de Menzel de R. et L. Ruess par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring a été financée par la RU 780/10-1. Enfin, nous sommes extrêmement reconnaissants à Mme Hazel Ruvimbo Maboreke pour la relecture de notre manuscrit.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
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