Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles
Summary
On décrit une méthode pour le fractionnement de la huntingtine mutante solubles et insolubles espèces de souris cérébrale et la culture cellulaire. La méthode décrite est utile pour la caractérisation et la quantification des flux de protéine huntingtine et sida en analysant l’homéostasie des protéines dans la pathogenèse de la maladie et en présence de perturbations
Abstract
L’accumulation de protéines mal repliées est au cœur de la pathologie de la maladie de Huntington (MH) et de nombreuses autres maladies neurodégénératives. Plus précisément, une caractéristique pathologique de la HD est l’accumulation aberrante de la protéine mutante de HTT (mHTT) dans des complexes de poids moléculaire élevé et inclusions intracellulaires composé de fragments et d’autres protéines. Les méthodes conventionnelles pour mesurer et comprendre que les contributions des diverses formes de mHTT contenant des agrégats incluent la microscopie en fluorescence, analyse par western blot et filtre piègent essais.
Cependant, la plupart de ces méthodes est la conformation spécifique et donc ne peut pas résoudre l’état complet du flux protéine mHTT en raison de la nature complexe de la solubilité globale et la résolution.
Pour l’identification des mHTT agrégée et les diverses formes modifiées et complexes, la séparation et la solubilisation des agrégats cellulaires et des fragments est obligatoire. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et visualiser mHTT soluble, monomères, oligomères, fragments, et un haut poids moléculaire insoluble (HMW) accumulé mHTT espèces. HMW mHTT des pistes avec la progression de la maladie, correspond avec lectures de comportement de la souris et a été bénéficiaire modulée par certaines interventions thérapeutiques1. Cette approche peut être utilisée avec le cerveau de souris, les tissus périphériques et culture cellulaire, mais peut être adaptée à d’autres systèmes modèles ou les contextes de la maladie.
Introduction
La perturbation des réseaux de contrôle de la qualité de protéines qui assurent le repliement adéquat et la dégradation des protéines cellulaires sont probablement centrale au département de pathologie de la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et autres « repliement » troubles de2,3. Une compréhension détaillée des composants réseau protéostasie et de leurs contributions à la pathologie sont donc cruciaux pour développer des interventions thérapeutiques améliorées. HD est causée par la dilatation anormale d’une répétition CAG dans le gène HD résultant dans un tronçon élargi de polyglutamines (polyQ) dans les protéines de la huntingtine (HTT)4. Une caractéristique constante pathologique de la pathogenèse de la HD est la résultante mauvais repliement, l’accumulation et l’agrégation de HTT dans certaines régions du cerveau et dans les tissus périphériques, qui s’est avéré interférer de plusieurs manières avec la fonction et l’homéostasie cellulaire normale 5 , 6. HTT tandis que s’exprime de façon ubiquitaire, moyennes neurones épineux dans le striatum sont sélectivement vulnérables et plus ouvertement touchés avec atrophie corticale notable, également associée à la pathogenèse de la HD.
Un marqueur de proxy pour la progression de la maladie et dominant négatif gain de fonction pour mHTT7a été généralement la formation d’agrégats de HTT dans le cerveau des patients de la HD et des modèles animaux. Bien que les mécanismes précis par quelles protéines mauvais repliement et agrégation peuvent contribuer à la toxicité induite par le mHTT demeurent obscures, la formation de ces inclusions dans le cerveau de patients HD et divers modèles animaux est une caractéristique invariante et inévitable. Inclusions semblent se composent en grande partie d’accumulé HTT fragments contenant du N-terminal élargi polyQ, indiquant que la protéolyse et traitement de pleine longueur HTT ainsi que8,d’épissage alternatif9 peut jouer un un rôle important dans la pathogenèse des fragments HTT HD. N-terminal peut constituer une forme pathologique de HTT pouvant regrouper rapidement, noyaux et accélérer ou propager l’agrégation processus10.
Toutefois, la présence de ces inclusions n’est pas nécessairement proportionnelle avec la toxicité induite par HTT ou cellule mort11. HTT a été proposé de subir un processus d’agrégation d’un monomère soluble par espèce oligomérique soluble et feuillet β fibrilles insolubles des agrégats et des inclusions12. Résoudre ces espèces de protéines différentes via des épreuves biochimiques standards a été un défi dans le domaine en raison de leur stabilité dans le tampon de lyse de la basse-détergent et difficulté à visualiser à l’aide des épreuves biochimiques standards. Ainsi, considérations méthodologiques sont essentielles pour détecter le degré et le mode de mHTT accumulé et agrégée.
Le protocole présenté ici permet de visualiser plusieurs intermédiaires de HTT, spécifiquement la formation d’une espèce de HMW HTT insoluble qui semble suivre de près avec HD pathogenèse et maladie progression1,13 ,14. Être capable de résoudre et de suivre les multiples espèces de mHTT fournit aux chercheurs un outil biochimique pour étudier la pathogenèse de la maladie et évaluer des interventions thérapeutiques potentielles par le biais de leur modulation et leur impact sur la pathogenèse de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quelques précautions sont nécessaires pour les protocoles ci-dessus garantir des résultats cohérents et quantitatives. Tout d’abord, mHTT dans les deux fractions sera spontanément forment des agrégats au fil du temps sur plusieurs cycles de gel dégel, notamment lorsque, dans une concentration élevée. Il est donc essentiel pour geler les aliquotes des protéine preps et décongeler uniquement le volume nécessaire avant d’exécuter l’essai tel que décrit dans le protocole ci-dessus. En outre, si la fractio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH (RO1-NS090390). Nous tenons également à remercier le Dr Joan Steffanfor assistance technique et la discussion lors de l’élaboration de ce test.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
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