Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

A incorporação genética de sondas químicas em proteínas é um método poderoso para facilitar a investigação dos aspectos estruturais e dinâmicos da função da proteína diretamente no contexto nativo da célula ao vivo. Hoje em dia, centenas de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) equipados com os mais diferentes grupos químicos podem ser site-specifically incorporadas em proteínas de biossíntese^1,2,3,4. Entre eles, reencontra-se foto-sensível ncAAs como crosslinkers-foto⁵, foto-enjaulado^6,7,8,9 e foto-comutável aminoácidos^{10, 11}, ácidos aminados, tendo tensas alcenos e alcinos por catalizador-livre opaco química^{2,12,13,14,15,16 ,17}, aminoácidos carregando dansyl¹⁸, cumarina^9,19e prodan^20,21 fluorophores e aminoácidos equipados com outras sondas biofísicas como bem como com post modificações translacionais^{1,2,3,4,22,23,24,25}.

A codificação genética de um ncAA é ativada por um dedicado amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) emparelhado com um supressor-tRNA cognato, que incorpora a ncAA em resposta a um codão stop âmbar durante a síntese ribossomal regular. pares de ncAARS/tRNA são projetados para serem ortogonais no organismo hospedeiro, ou seja, não a Cruz-conversa com os pares endógenos. A técnica é bem estabelecida, tanto em procariontes e eucariontes hospedeiros e células facilmente aplicáveis aos mamíferos. Pares para a incorporação da ncAA em células de mamíferos são baseados em três principais sistemas ortogonais: sistema de correntes, que combina o TyrRS de e. coli²⁶ com um supressor de correntes âmbar de b. stearothermophilus²⁷ (CE TyrRS / par deBstYam), o sistema (parCELeuRS/tRNA^Leu_CUA ) Escherichia coli de leucyl^6,18,28 e o sistema de pyrrolysyl de Archaea (PylRS/tRNA ^Pyl par)³, pelo qual o tRNA^Pyl é um supressor natural de âmbar. Em geral, cada ncAA é reconhecido por um ncAARS especializado. Dependendo da estrutura do ncAA, a ncAARS é obtido através de uma evolução dirigida de LeuRS, TyrRS ou PylRS, embora algumas sintetases podem aceitar mais de um ncAA.

O par ortogonal é importado para as células simplesmente usando um vetor do plasmídeo. Mais comuns e eficientes plasmídeos são bicistronic e codificam para a sintetase e o tRNA formando o par ortogonais²⁹. Um plasmídeo segundo a codificação da proteína de interesse, tendo um códon âmbar no local designado para a modificação é co transfectada. O ncAA é simplesmente adicionado ao meio de crescimento de célula. No entanto, diferentes grupos especializados muitas vezes usam diferentes variantes do plasmídeo construções mesmo para a incorporação do ncAA mesmo. Construções diferem no arranjo dos genes no vetor, tipo da sintetase, uso de códon no gene da sintetase, uso do promotor, variante do tRNA e número de fitas de expressão do tRNA. Além disso, a eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode variar drasticamente devido a eficiência catalítica diferente dos sintetases diferentes, a qualidade do tRNA e outros fatores³⁰. Portanto, é importante ter à mão um método rápido e confiável para avaliar a eficiência de um par de ortogonal, para escolher o sistema mais adequado para uma aplicação desejada e para executar algumas etapas de otimização que melhoram a expressão de proteínas totais rendimentos.

Nós estabelecemos um ensaio simples e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência dos pares ortogonais²⁹ (Figura 1). No ensaio, as células são co transfectadas com o plasmídeo de codificação para o par ortogonal, juntamente com um plasmídeo do repórter bicistronic codificação tanto para a proteína verde fluorescente, tendo um códon âmbar parada em uma posição permissiva (EGFP^TAG) e o gene mCherry. Vermelha e verde fluorescência da célula inteira lysates são lidos em canais separados em um leitor de placa em uma placa de 96 poços. A intensidade da fluorescência verde correlaciona diretamente com a eficiência da supressão de âmbar, Considerando que a intensidade da fluorescência vermelha dá uma estimativa direta do tamanho da amostra medida e a eficiência do transfection. No que diz respeito a ensaios semelhantes baseados em fluorescência assistida célula classificação (FACS) ler^31,,³², o ensaio dá uma avaliação imediata e abrangente da expressão da proteína da população celular, que é mais representativo das condições experimentais habituais e oferece uma fácil aquisição de dados e processamento com software padrão. Em geral, a principal vantagem do ensaio é que um meio para um grande número de amostras pode ser analisado em paralelo. Usando este ensaio, tem exibido uma biblioteca racionalmente concebida de supressor-tRNAs para melhorar a eficiência do sistema ortogonal Pyl³⁰. Este trabalho descreve o protocolo experimental para executar este ensaio e mostram exemplos de sua aplicação, incluindo a otimização do par ortogonal para a incorporação da foto-reticulação ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e a comparação de eficiências de incorporação de aminoácidos diferentes (Figura 2).

Nos últimos anos, foram comprovadas ferramentas ncAA muito poderosas para investigar estrutural e aspectos funcionais da proteína G acoplados a receptores (GPCRs)^{33,34,35,36,37 , 38}. em humanos, GPCRs formam uma grande família de receptores de membrana (800 membros) em representam os principais alvos para drogas terapêuticas. Caracterização estrutural direta de GPCRs é ainda um desafio e métodos bioquímicos complementares são altamente necessários para sua investigação. Nós temos pioneira no uso de foto-reticulação ncAAs para mapear as superfícies GPCR e descubra ligante vinculação bolsos³⁴. Usando nosso sistema otimizado para incorporação de Azi, incorporamos sistematicamente Azi em todo o domínio de toda juxtamembrane de um GPCR diretamente em células de mamíferos vivas. Após irradiação UV, Azi forma uma espécie de nitrene altamente reativos que capta covalentemente a moléculas vizinhas. Quando o ligante é adicionado ao sistema, Azi serve como uma sonda de proximidade para revelar quais as posições do receptor vem perto do ligante ligado. Desta forma, o modo de ligação do hormônio neuropeptídeo Urocortin (Ucn1) no receptor da classe B GPCR corticotropin-liberando-fator digito 1 (CRF1R)³³ foi primeiramente revelado. Ultimamente, nós temos divulgados padrões distintos de ligação dos agonistas e antagonistas sobre o mesmo receptor³⁸. Uma abordagem semelhante foi aplicada por outros para revelar orthosteric e sítios de ligação alostéricos de outros peptídeos e ligantes pequena molécula em outros GPCRs^39,40,41,42. Este manuscrito descreve o protocolo experimental aplicado em nosso laboratório para foto-reticulação mapeamento de superfícies GPCR. O método é relativamente rápido, simples e não requer nenhum equipamento especial, para que seja aplicável em laboratórios de bioquímica padrão. Importante, a abordagem fornece uma ferramenta valiosa não apenas para identificar sites de ligação do ligante onde dados estruturais 3D são escassos, mas também para complementar o existente em vitro dados com informações de receptores post-translationally totalmente modificadas na ambiente fisiológico da célula ao vivo.

O desenvolvimento recente do romance ncAAs rolamento sobre os lado da cadeia grupos químicos apropriados para ultra livre de catalisador opaco química abriu a possibilidade de instalar fluorophores de última geração para a imagem latente de super-resolução nas proteínas diretamente sobre o live células^2,43. Tais âncoras químicas incluem cyclooctyne tensa em SCOK¹⁴, biciclo [6.1.0] nonyne na BCNK^12,17e trans-cyclooctenes no TCO * K^13,15,17 , entre outros ncAAs abrigando um norbornene^16,17,44 ou^,ciclopropeno⁴⁵⁴⁶ moiety. NcAAs volumosos para opaco química são incorporados por uma variante do PylRS geralmente denotado como PylRS^AF (indicando a mutação Y271A e Y349F em M. barkeri PylRS), bem como por outras ad hoc evoluído ncAARSs^{17 , 44}. as âncoras opaco reagem com reagentes de tetrazine⁴⁷ via cicloadição de Diels-Alder elétron-demanda inversa para dar altos rendimentos rotulagem dentro de alguns minutos,^43,48. No entanto, aplicação desta abordagem poderosa para rótulo GPCRs tem sido desafiador devido a uma baixa eficiência global do sistema ortogonal de incorporação da ncAA. Usando o nosso avançado sistema de Pyl, demonstrámos alto rendimento incorporação de tais aminoácidos GPCRs e ultra rápida GPCR rotulagem na superfície de células de mamífero vivo³⁰recentemente. Rotulado de receptores foram ainda funciona, como eles fisiologicamente internalizado em cima ativando o receptor com um agonista. O protocolo experimental para a incorporação de opaco Ancora em GPCRs e etiquetando as etapas a seguir são descritas aqui. Equipar GPCRs com pequenas fluorophores brilhante é o primeiro passo fundamental para o estudo da dinâmica estrutural GPCR na célula ao vivo através de técnicas avançadas de microscopia.